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탄소 중립성에 대한 요구가 증가함에 따라 저탄소 생산의 새로운 기술과 모드가 개발되었습니다. 저비용 재생 가능 자원을 보다 가치 있는 화학 물질로 전환하기 위한 미생물학의 활용이 특히 중요합니다. 그래서 셀룰로오스 분해 세균인 Bacillus subtilis 의 능력을 조사한 논문을 소개할까 합니다.

스위치그래스 리그노셀룰로오스 분해에서 1AJ3. 균주를 37℃에서 5일 동안 배양한 뒤의 셀룰로오스, 자일란 및 산불용성 리그닌 분해율은 각각 16.13, 14.24 및 13.91%이었습니다. 가스 크로마토그래피-질량 분석법(GC-MS) 분석 및 전계 방출 주사 전자 현미경(FE-SEM)은 스위치그래스의 리그닌과 표면이 박테리아 균주와 함께 배양된 후 분해되었음을 나타냅니다. 균주 1AJ3은 대부분의 셀룰라아제의 최적 온도(50°C) 조건을 만족시키는 60°C 이하에서 잘 자랄 수 있습니다. 후속 결과는 산-열 인큐베이션 조건이 B. subtilis 에 의해 분해되는 광범위한 셀룰로오스 바이오매스에서 환원당 함량을 증가시킨다는 것을 강조합니다. 더 많은 환원당을 얻기 위해 올리고당으로의 셀룰로오스 분해의 마지막 단계에서 중요한 역할을 하는 β-글리코시드 가수분해효소에 집중했습니다. β-글리코시드 가수분해효소(Bgl-16A)는 대장균에서 클로닝 및 발현을 특징으로 했습니다. Bgl-16A는 365.29 ± 10.43 U/mg의 효소 활성을 가지며, 효소의 작용 방식은 분자 도킹으로 설명됩니다. 또한, Bgl-16A의 온도(50°C)에 대한 결정적인 영향은 산열 조건에서 균주에 의한 바이오매스의 고효율 분해를 설명합니다. 잠재적인 응용 측면에서 균주와 재조합 효소 모두 커피 찌꺼기가 적합하고 가치 있는 기질이 될 것임을 보여주었습니다. 이 연구는 B. subtilis 에 의한 셀룰로오스 분해에 대한 새로운 이해를 제공합니다. 효소 작용 방식과 셀룰라아제에 의한 최적 온도 제한이 모두 분해에 영향을 줄 수 있음을 알 수 있습니다. 또한 녹색제조업의 산업생산에 있어서 독특한 우위 활용에 대한 새로운 시각을 제시하였습니다.

서론

에너지 전환은 개발도상국의 환경, 기후 및 경제에 도움이 되는 탄소 중립성을 향한 핵심 전환입니다. 에너지 전환과 저탄소 생산을 달성하기 위해 가장 중요한 부분은 화석 연료에서 재생 에너지원으로 전환하는 것입니다. 식물 기반 리그노셀룰로스 물질은 다중 탄소 성분과 그 파생물이 설탕, 알코올, 지질 및 푸르푸랄과 같은 추가 합성을 위해 고체 또는 액체 기본 물질로 변형될 수 있기 때문에 바이오 연료 및 생물전환 제품의 주요 기질이 되었습니다. 바이오 연료 산업은 바이오매스 리그노셀룰로스의 추가 활용을 위한 중요한 영역입니다. 여러 식물, 작물, 미세조류를 포함한 바이오매스, 공정 부산물 또는 폐기물은 지구상에서 가장 풍부한 면적을 가지고 있으며 바이오연료의 주요 공급원료가 되는 재생 가능한 특성을 가지고 있습니다. 높은 에너지 매장량과 낮은 식재 비용으로 인해 바이오연료 생산에 적합한 스위치그래스는 바이오매스 분해 연구에 널리 사용되었습니다, 액체 연료 평가, 분자 육종 연구, 더욱이, 밀짚 및 옥수수 짚과 같이 쉽게 버려지는 다른 셀룰로스 물질은 분해를 위한 셀룰로스 기질이 될 수 있습니다.

리그노셀룰로오스를 환원당으로 전환하는 당화는 항상 바이오연료 전환율과 수율의 핵심 공정 제한 요소입니다. 리그노셀룰로오스 구조는 특히 헤미셀룰로오스와 리그닌이 존재할 때 셀룰로오스-셀룰라아제의 직접적인 상호작용을 방지하기 때문에 가수분해하기 어렵게 만듭니다. 전처리는 리그노셀룰로오스의 거친 구조를 약화시켜 셀룰로오스를 환원당에 더 쉽게 접근할 수 있도록 합니다. 물리적, 화학적 및 생물학적을 포함한 전처리 방법의 조합은 산업 공정에서 일반적으로 사용됩니다. 생물학적 방법은 잠재적인 분해 능력 때문에 지난 몇 년 동안 더 많은 관심을 받았습니다. 박테리아는 풍부한 효소 시스템, 빠른 성장, 내압성 및 유전자 조작의 용이성으로 인해 더 많은 관심을 끌었습니다. 더욱이, 다양한 유형의 셀룰로오스는 박테리아가 다양한 셀룰라아제를 생성하도록 유도하여 미생물 리그노셀룰로오스를 특정 소스로 만듭니다. 따라서, 광범위하게 바이오매스 기질 분해된 박테리아가 바람직할 것이다.

셀룰라아제는 셀룰로스 분해를 위한 효소 시스템으로 구성되며, 작용 모드에 따라 엔도-셀룰라아제, 엑소-셀룰라아제 및 베타-글리코시드 가수분해 효소의 세 가지 클래스로 나뉩니다 . 엔도 셀룰라아제와 엑소 셀룰라아제 모두 긴 셀룰로스 사슬을 짧은 사슬 또는 올리고당으로 가수분해할 수 있습니다. 차이점은 endo-cellulase는 무작위로 가수분해되는 반면 exo-cellulase는 셀룰로오스 사슬의 끝에서만 cellobiose를 가수분해할 수 있다는 것입니다. 그 후, 베타-글리코시드 가수분해효소는 올리고당을 단당류로 가수분해하여 추가 부가가치 제품을 위한 재료를 제공합니다. 따라서 베타-글리코시드 가수분해효소는 셀룰로오스를 단당류로 완전히 가수분해하는 데 중요한 역할을 하며 속도 제한 단계이기도 합니다. 또한 베타-글리코시드 가수분해효소는 식품, 사료 및 바이오연료 산업과 같은 다양한 생분해 과정에 영향을 미칩니다. 박테리아는 배당체 가수분해효소의 풍부한 공급원이며, 특히 Bacillus 종은 산업 분야에서 엄청난 응용 가능성을 보여주었습니다.

우리의 이전 연구에서 셀룰로오스 분해 박테리아인 B. subtilis1AJ3는 친링 산맥의 썩은 숲에서 격리되었습니다. 이 균주는 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨과 Avicel을 탄소원으로 사용하여 성장할 수 있으며 이론적으로 바이오매스에서 셀룰로오스를 분해할 수 있습니다. 이 연구는 1AJ3 균주에 의한 바이오매스의 특정 분해 능력을 평가했습니다. 그러면 균이 자라는 온도가 셀룰라아제 활성을 위한 최적의 온도와 일치하지 않기 때문에 배양 온도 인자의 증가가 당화율을 향상시키는 것으로 생각되었다. 셀룰로오스 분해 과정 중 제한 요인을 더 잘 이해하기 위해 올리고당을 단당류로 가수분해하는 마지막 단계의 가수분해 효소인 베타-글리코시드 가수분해 효소에 초점을 맞췄습니다. 균주 B. subtilis 의 재조합 베타-글리코시드 가수분해효소1AJ3은 대장균 BL21(DE3) 에서 클로닝 및 발현을 특징으로 합니다 . 또한 Bgl-16A의 이론적인 기작을 기질 분자 도킹을 통해 연구하였다. 우리의 결과는 베타-글리코시드 가수분해효소가 가수분해 활성 작용 모드와 엄격한 작용 온도로 인해 B. subtilis 균주 1AJ3 에 의한 셀룰로오스 분해에 대한 제한 요인이 될 것임을 보여주었습니다 . 또한 우리는 커피 찌꺼기가 박테리아 균주나 베타-글리코시드 가수분해 효소가 분해할 수 있는 바이오 연료의 잠재적인 기질이 될 수 있음을 발견했습니다.

재료 및 방법

균주, 플라스미드 및 배지

Bacillus subtilis 1AJ3(GenBank No. MG062801)은 Qinling 산의 썩은 나무에서 분리되었습니다. 박테리아는 LB 배지(NaCl 10g/L, 트립톤 10g/L, 효모 추출물 분말 5g/L), 스위치그래스 단일 탄소원 배지(7%), 이온성 액체(NH 4 ) 2 SO 에서 성장 시켰다 . pH 7.2 또는 5.6에서 4 2.0 g/L, MgSO 4 7H 2 O 0.5 g/L 및 K 2 HPO 4 1.0 g/L. 배지는 사용 전 121°C에서 20분간 멸균하였습니다.

플라스미드 pET-28a를 사용하여 재조합 발현 벡터를 구성하였다. 대장균 BL21(DE3)을 발현 숙주로 사용하였다. 제한 엔도뉴클레아제 Nco I 및 Xho I은 Takara에서 구입했습니다. DNA 추출 키트, 플라스미드 추출 키트 및 PCR 정제 키트는 Omega Bio-Tek, Inc.에서 구입했습니다. Primer 합성 및 시퀀싱은 Sangon Biotech Inc.(Shanghai)에 위탁했습니다.

환원당 함량 및 셀룰라아제 활성 측정

배양 배지에서 감소된 당 함량은 DNS 방법에 의해 결정되었다. CMCase 활성은 이전에 기술된 바와 같이 분석했습니다. CMCase의 1단위(U)는 특정 pH와 온도에서 1분 동안 1μmol의 포도당을 생성하는 효소의 양을 의미합니다.

재조합 베타-글리코시드 가수분해효소 활성은 기질로서 p-NPG(4-Nitrophenyl β- D -galactopyranoside, CAS: 3150-24-1)를 사용하여 50°C에서 10분 동안 p-NP( p -Nitrophenol, CAS : 100-02-7)을 기준으로 합니다. 베타-글리코시드 가수분해효소의 1단위(U)는 분당 1μmol의 p-NP를 방출하는 데 필요한 효소의 양으로 정의되었습니다.

균주 Bacillus subtilis 1AJ3 에 의한 스위치그래스의 가수분해 및 분석

Bacillus subtilis 1AJ3는 CMC-Na 액체 배지에서 37°C, 150 rpm으로 48시간 동안 성장했습니다. 박테리아를 4°C에서 10분 동안 10,000 x g 에서 원심분리하여 수집 하고 OD 600nm 1.0 에서 멸균 배양 배지 이온성 액체에 재현탁했습니다 . 10%의 세포를 스위치그래스 배지로 옮기고 37°C, 150rpm에서 5일 동안 배양하여 접종을 수행했습니다. pH를 매일 모니터링하였다. 블랭크는 박테리아가 없는 접종 배지로 설정되었습니다.

분석을 위해 배양액을 배양액과 불용성 잔류물의 두 가지로 나누었습니다. 배양액은 12,000× g 에서 원심분리하여 배양액에서 분리하였다 . 스위치그래스 잔류물을 샌드 코어 연료에서 여과하고 증류수로 헹구고 60°C에서 밤새 오븐 건조했습니다. 배양액의 총 환원당 함량은 앞서 기술한 바와 같이 DNS에 의해 결정되었다. 배양액 및 스위치그래스 잔사의 셀룰로오스 조성 분석은 산가수분해를 이용하여 수행하였습니다. NREL(National Renewable Energy Laboratory) 지침에 따라 분해된 저분자당을 검출하고 배양액 및 건조 스위치그래스 잔류물에서 셀룰로오스 및 자일란 분해 수준을 계산합니다. 결과는 세 번의 독립적인 실험의 "평균 ± 표준 편차"로 표시됩니다.

전계 방출 주사 전자 현미경 및 가스 크로마토그래피-질량 분석 분석

B. subtilis 1AJ3 와 함께 5일 동안 배양한 분해된 스위치그래스 시료와 블랭크 시료를 전계 방출 주사 전자 현미경(FE-SEM)으로 분석하여 박테리아에 의한 리그노셀룰로오스 가수분해를 가시화하였습니다 . 가스 크로마토그래피-질량(GC-MS) 분광법을 사용하여 박테리아에 의한 스위치그래스 리그노셀룰로오스 가수분해를 평가했습니다. FE-SEM 및 GC-MS는 이전에 설명한 대로 수행되었습니다. 대조군은 세균이 없는 처리였다. 보존 시간(RT)을 기반으로 NIST 라이브러리에 대해 벤젠 고리 화합물의 존재를 확인했습니다.

Bacillus subtilis 1AJ3 열안정성 및 다양한 셀룰로오스 재료에서의 응용

공업적 생산 및 효소 반응 공정시 고온이 필요하며 셀룰라아제 활성을 위한 최적의 온도는 50°C입니다. B. subtilis 1AJ3는 다른 온도에서 성장하도록 허용되었으며 가장 높은 허용 온도가 기록되었습니다. 간략히 설명하면, B. subtilis 1AJ3를 플레이트에 현탁액을 코팅하여 60, 80 및 100°C에서 2일 동안 배양했습니다. 플레이트(Congo-red를 포함하는 고체 배지) 상의 박테리아 콜로니 수 및 성장 진술은 24시간 및 48시간 후에 관찰될 것이다.

적합한 바이오매스 셀룰로오스 기질 B. subtilis 1AJ3를 식별하기 위해, 10가지 유형의 바이오매스 셀룰로오스 물질, 스위치그래스, 밀짚, 옥수수 줄기, 옥수수 속대, 왕겨, 사탕수수 줄기, 완두콩 짚, 생강 줄기 및 잎, 땅콩을 분해하는 박테리아의 능력 껍질과 커피 찌꺼기를 조사했습니다. 미가공 바이오매스 셀룰로오스를 분쇄하고 60℃에서 건조시킨 후 무게를 쟀다. 계량된 샘플을 100°C에서 2시간 동안 배양하고 오염을 최소화하기 위해 박테리아 현탁액에 첨가했습니다. 박테리아를 LB 배지에서 배양하고 세포를 10,000 x g 에서 10분 동안 4°C에서 원심분리하여 수집했습니다. 세포를 다른 pH에서 이온 액체를 사용하여 세척하고 추가 분석을 위해 OD 600nm = 1.0으로 재현탁했습니다.

이전에는 4.0의 초기 매체 pH가 더 높은 환원당 함량을 제공하는 것으로 나타났습니다. B. subtilis 1AJ3은 pH 4.0 및 80 ° C 성장 온도에 저항할 수 있었고 대부분의 셀룰라아제의 최적 온도가 50°C인 것을 고려하여 박테리아의 바이오매스 셀룰로스 분해를 두 가지 조건에서 평가했습니다. 조건 1: 초기 배지 pH 7.0, 37 °C, 72시간 동안 150rpm. 조건 2: 초기 배지 pH 4.0, 50℃, 150rpm에서 72시간. 분해 상태 및 환원당 함량을 평가하였다. 변형이 없는 처리는 공란으로 설정하였다.

대장균 에서 재조합 Bgl-16A의 발현 및 정제

B. subtilis 1AJ3의 베타-글리코시드 가수분해효소 유전자 bgl -16A 는 1차 연구에 따라 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 통해 게놈 DNA에서 증폭되었습니다( Ma et al., 2020c ). 이중 분해( Nco I 및 Xho I) 및 pET-28a(+) 플라스미드 및 PCR 생성물의 T4 리가제와의 결찰을 통해 재조합 발현 벡터를 구축하였다. 재조합 Bgl-16A는 C-말단에 His-태그를 함유하였다. 서열화된 bgl -16A를 갖는 재조합 벡터를 42℃에서 90초 동안 열 충격에 의해 대장균 BL21(DE3) 적격 세포 로 옮겼다 .

재조합 대장균은 37℃에서 회전 진탕기(220rpm)에서 100㎍/mL 카나마이신을 함유하는 LB 액체 배지에서 배양되었다. 재조합 Bgl-16A 단백질은 25℃에서 10시간 동안 0.6의 OD 600nm 에서 0.4 mM의 IPTG(isopropyl-β-thiogalactopyranoside)로 유도되었다. 유도 후, 4℃에서 10분 동안 10,000 rpm에서 원심분리하여 상청액을 수집하고 1X PBS 완충액(pH 7.2)으로 2회 세척하였다. 세포를 1X PBS 완충액에 재현탁한 후 SCIENTZ-IID 초음파 균질화기를 사용하여 20분 동안 초음파 처리했습니다. 12,000g 에서 원심분리하여 세포 파편을 제거했습니다.4°C에서 20분 동안. 상청액을 수집하고 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용했습니다. 결합되지 않은 단백질을 40mM 이미다졸로 세척하고 재조합 his-태그된 Bgl-16A 단백질을 1X PBS 완충액(pH 7.2)에서 200mM 이미다졸로 용출시켰다. 용출된 단백질과 정제된 단백질을 10% SDS-PAGE로 검출하였다. 단백질 함량은 BCA 방법으로 측정하였다.

Bgl-16A의 생화학적 특성

셀룰라아제 활성에 대한 pH의 영향은 인산염(pH 2.4-8.0) 및 Tris-HCl(pH 8.5-11.0) 완충액을 사용하여 50°C에서 10분 동안 pH 범위 2.4-11.0에 걸쳐 효소 활성을 분석하여 결정되었습니다. pH 안정성 분석을 위해 효소를 기질 없이 30분 동안 다른 완충액에서 50°C에서 인큐베이션한 다음 50°C에서 10분 동안 효소 활성을 측정했습니다.

반응 온도의 영향은 최대 pH에서 30분 동안 0 ~ 100°C(10°C 간격)에서 측정되었습니다. 효소의 열적 안정성은 위와 동일한 온도에서 30분 동안 평가한 후 통제된 조건에서 효소 활성을 측정하였다.

금속 이온(Na +,  K + , Cu 2+ , Mg 2+ , Zn 2+ , Mn 2+ , Fe 2+ , Fe 3+ , Ca 2+ , [NH 4 ] + ) 및 화학 물질 나트륨 의 영향 10, 5 및 1mM 농도의 도데실 설페이트(SDS) 및 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)의 효소 활성은 실온에서 10분 동안 사전 배양한 후 표준 조건에서 측정되었습니다. 대조군에 대해 결정된 효소 활성을 100%로 설정하고 각 조건 하에서의 상대적 활성을 기록하였다.

우리는 Bgl-16A와 Cel-A 사이의 시너지 효과를 확인했으며 엔도 셀룰라아제가 균주 1AJ3에서 클로닝되었습니다. 1% CMC-Na, 1% Avicel 및 여과지를 기질로 사용하여 단일 효소 또는 결합 효소(V:V = 1:1)로 셀룰라아제 활성을 검출하였습니다. 효소 반응의 시너지 계수는 DS = U All / (U 1 + U 2 + …)로 정의하였으며, DS 값 > 1은 효소가 시너지 효과를 갖는다는 것을 의미합니다.

기판과의 분자 도킹

Bgl-16A의 아미노산 서열을 PDB 데이터베이스와 비교하였다.1 및 NCBI와 단백질 ID 3O5S와 99.08%의 동일성을 나타내어 서열의 86%를 커버하였다. 효소 활성 부위 선택은 단백질 3O5S에 따랐다. Bgl-16A 구조는 AlphaFold 2를 통해 얻었고 분자 도킹은 AutoDock 소프트웨어를 통해 수행되었습니다.

p-NPG 및 셀로비오스의 리간드 분자를 ChemDraw 소프트웨어에서 추출하고 초기에 RMS 0.001로 Chem3D(MM2 모듈)로 최적화했습니다. 단백질은 분자 도킹 수용체로 설정되었습니다. AutoGrid 4 모듈이 포함된 AutoDock 도구는 도킹을 수행하는 데 사용되었으며 이전 연구를 기반으로 E134 및 E138을 활성 아미노산 잔기로 정의했습니다 . AutoDock 소프트웨어는 100개의 도킹 결과를 완료하고 가장 적합한 것을 결정했습니다.

베타-글리코시드 가수분해효소에 의한 스위치그래스 및 커피 찌꺼기 당화

리그노셀룰로스 스위치그래스를 40메쉬 크기로 분쇄하고 커피 찌꺼기를 증류수로 세척하였다. 리그노셀룰로스 스위치그래스와 커피 찌꺼기를 60°C에서 밤새 건조했습니다. 완충액(pH 8.6)의 조 재조합 효소를 50°C에서 20시간 동안 5%(w/v) 스위치그래스로 당화했습니다. 조 효소 밀도의 세 가지 등급은 10, 20 및 40%(v/v)로 설정되었습니다. 이후 당화율은 다음과 같이 계산되었습니다.

데이터 및 통계 분석

각 실험은 3회 수행되었으며 결과는 Excel 2019를 통해 계산된 평균 ± SD로 표시됩니다. 

결과

스위치그래스 분해 과정 중 문화의 변화

Bacillus subtilis 1AJ3를 스위치그래스와 함께 37℃, 150rpm에서 5일 동안 배양하였다. 스위치그래스 분해 동안 배양물의 pH는 3일째부터 7.5로 안정화되었습니다. 이 분석은 배양 배지가 초기에 산성이었기 때문에 균주가 산성 pH에서 성장할 수 있음을 보여주었습니다. 또한 균주는 배양 환경의 pH를 수정하여 성장에 도움이 됩니다.

분해 과정 동안 배양물에서 CMCase 활성은 처음에 증가했고 3일째에 최대 활성(7.49 U/100 mL)에 도달했습니다. 4일 후 감소하고 안정화되었습니다(3.94 U/100 mL). 공동 배양 동안 박테리아는 스위치그래스를 분해하여 환원당을 생성하고 환원당을 에너지로 소비했습니다. 따라서 환원당 함량은 두 사건의 순생산물입니다. 총 환원당 함량은 처음에 하향 추세를 보였고 3일째에 안정화되었습니다. 처음 3일 동안 박테리아는 자체 성장 요구를 충족시키기 위해 환원당을 소비했습니다. 그 후 스위치그래스 분해와 박테리아 대사의 안정화가 안정화되기 시작하여 당 수준을 약 1.13mg/mL로 낮추었습니다.

Bacillus subtilis 1AJ3 에 의한 Switchgrass lignocellulose 분해

스위치그래스는 B. subtilis 1AJ3 와 함께 5일 동안 배양하였고 , 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스(주로 자일란) 및 산불용성 리그닌 함량을 매일 모니터링하였습니다. 또한, 배양액 중의 글루칸 및 자일로스 함량을 HPLC로 측정하여 셀룰로오스 및 자일란 함량을 산출하였습니다.

박테리아를 사용한 배양 시간은 스위치그래스의 무게를 점진적으로 감소시켰고 스위치그래스 입자 크기는 감소시켰고 배양 유동성은 증가시켰습니다. 5일 동안 스위치그래스 셀룰로오스 및 자일란 헤미셀룰로오스 분해는 각각 16.13 및 14.24%였습니다. 산 불용성 리그닌 분해는 이 기간 동안 13.91%였습니다. 또한 산성 환경은 배양액에서 당을 가수분해시킬 수도 있습니다. 셀룰로오스 및 자일란 분해도 총 건조 중량에 비례하여 결정되었습니다. 마지막으로, B. subtilis 1AJ3에 의한 스위치그래스 가수분해와 그 에너지 소비는 상대적으로 유지되었습니다.

가스크로마토그래피-질량분석법에 의한 리그닌 분해 분석

스위치그래스 분해 중에 리그닌 함량이 감소하기 때문에 GC-MS를 사용하여 B. subtilis 1AJ3에 의한 리그닌 분해를 확인했습니다. 리그닌은 벤젠 고리를 가지고 있기 때문에 벤젠 고리를 가진 화합물의 분석은 일반적으로 리그닌 함량을 검출하는 데 사용됩니다. GC-MS는 스위치그래스 시료의 전처리 및 메틸실릴화 후 저분자량 벤젠 고리 함유 화합물을 정량화했습니다. 각 성분에 해당하는 방향족 화합물은 NIST 데이터베이스에서 확인되었습니다. 서로 다른 성분의 피크 면적을 통합하고 모든 방향족 화합물의 총 면적을 100%로 설정했습니다. 이어서, 상이한 벤젠 고리 함유 화합물의 비율(%)을 총 피크 면적에 대한 각각의 피크 면적으로 결정하였습니다.

방향족 화합물이 주요 리그닌 분해 관련 성분이므로, B. subtilis 1AJ3 대 블랭크 샘플 에서 벤젠 고리를 포함하는 방향족 화합물을 분석한 결과 큰 방향족 화합물이 더 작은 분자량 성분으로 분해되는 것으로 나타났습니다. 고분자량 방향족 화합물, 이소바닐산(CAS: 645-08-9), 1-hydroxy-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl) acetone(CAS: 4899-74-5) 및 트랜스페룰산( CAS: 537-98-4)은 B. subtilis 로 배양한 후 더 작은 성분으로 완전히 분해되었습니다.5일 동안 1AJ3. 성분 3-allyl-6-methoxyphenol(CAS: 501-19-9)은 부분적으로 분해되었으며, 그 함량은 균주와 함께 배양된 후 스위치그래스 시료에서 현저히 낮았다. 방향족 성분의 환원 외에도 2-메톡시페놀(CAS: 90-05-1), 쿠마린(CAS: 496-16-2), 페닐아세트산(103-82-2) 등 새로운 방향족 성분도 생성됩니다.

전계 방출 주사 전자 현미경에 의한 스위치그래스 열화 분석

FE-SEM은 B. subtilis 1AJ3 로 배양 전후 스위치그래스를 이미지화하는 데 사용되었습니다. 이 분석은 스위치그래스가 매끄럽고 콤팩트한 상태에서 완전히 조각난 상태로 진행됨을 발견했으며, 이는 박테리아가 스위치그래스를 상당히 분해했음을 나타냅니다.

산열 조건에서 Bacillus subtilis 1AJ3 의 내열성 과 바이오매스 분해

B. subtilis 1AJ3는 100°C 이하에서 자랄 수 없지만 80°C까지 견딜 수 있으며 일부 집락은 24시간 이내에 자랍니다. 더욱이 가장 놀라운 발견은 B. subtilis 1AJ3가 60°C에서 번성한다는 것입니다. 우리는 이전에 B. subtilis 1AJ3 에 대한 배지의 초기 pH의 영향을 평가했으며 박테리아가 높은 수준의 환원당 축적으로 낮은 pH(4.0)에서 성장할 수 있음을 발견했습니다. 낮은 pH 환경도 일부 셀룰로오스를 가수분해할 수 있기 때문에 균주가 바이오매스 셀룰로오스를 분해하기 위한 산 가열 성장 조건이 선호됩니다.

균주 1AJ3에 의한 두 가지 가수분해 조건을 바이오매스 원료에 적용하였습니다. 어떠한 원료도 전처리하지 않고 고온에서 처리하여 원료의 부착을 줄이고 다른 미생물을 억제하여 실험에 미치는 영향을 최소화하였습니다. 배양액의 환원당 함량은 3일 만에 동적 평형에 도달하므로 본 실험에서는 환원당 함량을 3일째에 결정하였습니다. 상이한 조건 하에서의 당 함량 감소를 비교하였습니다. 그런 다음 다양한 분해 조건에서 균주 1AJ3을 사용하여 산업용 에탄올 발효를 위한 다양한 바이오매스 리그노셀룰로오스의 실행 가능성을 평가했습니다.

테스트된 두 가지 조건에서 B. subtilis 1AJ3는 밀짚 및 왕겨에 거의 영향을 미치지 않았습니다. 그러나 스위치그래스, 옥수수 짚, 사탕수수 짚, 짚 속의 생강 및 땅콩 껍질에서 생성된 환원당 함량은 조건 2를 사용할 때 약간 더 높았다. 조건 1보다 조건 2는 옥수수 속대( 그림 4D ), 완두콩 짚( 그림 4G ) 및 커피 찌꺼기( 그림 4J) 에서 상당히 높은 수준의 환원당을 생성합니다.). 동일한 배양 회전 속도와 시간에서 박테리아가 환원당을 생산하기 위한 셀룰로오스 분해와 환원당 소비가 동적 평형 상태에 있을 때 조건 2(50°C, 초기 pH 4.0)는 조건에 비해 바이오매스 분해에 더 도움이 됩니다.

성장을 위한 박테리아의 환원당 함량 이용률은 셀룰로오스 분해로 생성된 환원당보다 더 커서 감소 추세를 보였습니다. 그러나 왕겨, 완두콩 짚 및 커피 찌꺼기는 상승 추세를 보였고, 커피 찌꺼기는 두 조건 모두에서 상승 추세를 보였습니다.

재조합 Bgl-16A의 발현 및 정제

bgl -16A 유전자 서열(732bp)은 244개의 아미노산을 암호화하는 것으로 나타났습니다 . 총 252개의 아미노산 서열을 갖는 C-말단에 His-태그를 포함하는 재조합 효소 Bgl-16A가 GenBank 액세스 번호 QIP68091.1로 NCBI 데이터베이스에 제출되었습니다. 아미노산 서열 폭발은 효소가 글리코실 가수분해효소(GH) 계열에 속하는 베타-1,3-1,4-글루카나제(PBD id: 3O5S)의 서열과 99.08% 동일성 및 86% 커버리지를 가짐을 보여주었습니다. 

재조합 베타-글리코시다아제 가수분해효소는 대장균 에서 발현되었고 Ni-NTA 컬럼을 사용하여 정제되었습니다. 40mM 이미다졸을 사용하여 불순한 단백질을 제거한 후 정제된 단백질은 200mM 이미다졸을 사용하였다. 정제된 재조합 Bgl-16A 및 정제 과정을 나타내었다 . 정제된 Bgl-16A의 분자량( Mw )은 약 26kDa로 예상 분자량과 일치하였다. 정제된 재조합 Bgl-16A는 365.29 ± 10.43 U/mg의 높은 효소 활성을 보였습니다.

재조합 Bgl-16A의 특성

상이한 pH 및 온도에서 재조합 Bgl-16A의 효소적 및 생리학적 특성화는 최적 pH가 8.6이고 온도가 50℃임을 보여주었습니다. 최대 효소 활성의 80% 이상이 pH 7.0과 9.0 사이에 도달하여 Bgl-16A가 중성 및 약알칼리성 반응 조건에 적합함을 나타냅니다. 4.5 미만의 pH 수준에서 재조합 단백질 침전물 및 활성 손실이 관찰되었습니다. Bgl-16A에 대한 최적의 안정성 pH는 6.4와 9.0 사이에 있습니다, 상대 효소 활성이 93% 이상입니다. Bgl-16A의 최적 온도는 50°C였습니다. 따라서 엄격하게 온도가 필요한 효소입니다. 50°C 이상 또는 이하의 온도에서는 효소 활성이 50% 미만으로 감소했습니다. 60°C에서 30분 동안 효소 활성이 검출되지 않았습니다. Bgl-16A는 고온에서 어떠한 내열성 특성도 나타내지 않았지만 저온에서는 안정적인 활성을 보였습니다.

재조합 Bgl-16A 베타-글리코시드 가수분해효소 활성에 대한 금속 이온의 효과는 거의 금속 이온이 효소 활성을 증가시키지 않았습니다. 이에 비해 Ca 2+는 다른 농도에서 효소 활성을 감소시킬 수 있습니다. SDS는 또한 효소 활동에 영향을 미치지 않았습니다. EDTA는 고밀도(5mM 이상)에서 효소 활성을 억제할 수 있는 반면 저밀도(1mM)에서는 그렇지 않았습니다. 또한 시너지 효과는 Bgl-16A와 endo-cellulase Cel-5A가 CMCase, Avicelase 및 FPase에서 각각 DS 값이 1.195, 1.303 및 1.247로 상승 작용을 함을 시사하였다 .

서열 분석, 상동성 모델 및 분자 도킹

재조합 효소는 His-tag를 포함하여 252개의 아미노산으로 구성됩니다. 이론적인 pI와 분자량은 각각 6.79와 28.55 kDa로 측정되었습니다. Bgl-16A는 베타 샌드위치 구조를 나타내는 아미노산 35-242에 걸쳐 있는 GH16 도메인을 가지고 있습니다. 상동성 모델은 AlphaFold 2를 기반으로 합니다. 촉매 잔기의 활성 부위는 PBD 데이터베이스의 3O5S 구조에 따라 134E와 138E였습니다. 단백질은 이전 연구에서와 같이 두 개의 병치된 구부러진 역평행 베타 시트의 전형적인 구조를 보여주었습니다 . 그러나 이전 연구에서는 베타-1,3-1,4-글루카나아제를 조사하기 위한 효소 가수분해 기질로 이끼만을 고려했으며 분자 도킹을 위해 비스-트리스-프로판 분자를 사용했습니다.

분자를 100번 도킹하고 도킹이 끝날 때까지 RMSD 값을 사용하여 다른 그룹으로 나누었습니다. 보충 파일 2 에 표시된 분자 도킹 결과의 클러스터 분석p-NPG가 cellobiose와 비교할 때 도킹 및 클러스터링이 더 우수함을 나타냅니다. p-NPG는 Bgl-16A 공동에 안정적으로 결합할 수 있으며 결합 에너지는 –5.72 kcal/mol입니다. -7.0보다 낮은 AutoDock 점수 값은 대상이 화합물과 강한 결합 능력을 가지고 있음을 나타냅니다. 반대로 -5.0에서 -7.0 사이의 점수 값은 화합물의 작은 분자가 표적과 좋은 결합 능력을 가지고 있음을 나타내고, -5.0에서 -4.25 사이의 점수 값은 화합물이 표적과 어느 정도 결합 능력을 가지고 있음을 나타냅니다. 거대 분자 표적. p-NPG는 주로 소수성 상호작용, 수소결합, π-스태킹(침전) 상호작용을 통해 작용했습니다. p-NPG는 단백질의 TRP221 및 TRP213과 소수성 상호작용을 형성할 수 있습니다. 수산기는 ASP136, GLU138, GLN148, ASN150, TYR152 및 GLU160과 수소결합 공여체로 안정적인 수소결합을 형성할 수 있다. 벤젠 고리는 또한 PHE59와 π-스태킹(stacking) 공액 상호작용을 형성할 수 있습니다.

Cellobiose는 -4.78kcal/mol의 결합 에너지로 단백질 공동에 안정적으로 결합할 수 있습니다. 셀로비오스 분자는 주로 소수성 상호작용과 수소결합 상호작용을 통해 상호작용한다. 화합물은 MET58, TRP132, TYR123 및 PHE121과 소수성 상호작용을 형성할 수 있습니다. 화합물의 수산기는 수소결합 공여체로 작용하여 단백질의 GLN134, ASP136, GLU138, GLN148, ASN150, TYR152, GLU160과 안정한 수소결합을 형성할 수 있으며, 이것이 활성 부위와의 결합을 촉진하는 주된 힘입니다.

리그노셀룰로오스 전처리에서 Bgl -16A 의 잠재적 응용

리그노셀룰로스 또는 바이오매스 폐기물에서 Bgl-16A의 적용을 추가로 탐색하기 위해 리그노셀룰로스 스위치그래스를 기질로 사용하여 가수분해 및 당화 능력을 감지했습니다. 또한 커피 찌꺼기를 기질로 적용하여 적용 범위를 넓혔습니다. 조 효소는 실험의 이 부분에 사용되었습니다.

20시간 동안 효소 배양 후, 가수분해 현상이 명백하였습니다. 걸쭉한 셀룰로오스 입자는 가늘고 느슨해졌으며, 리그노셀룰로오스는 효소량이 증가함에 따라 얇아졌다. 이것은 특히 커피 찌꺼기의 경우에 해당되며, 암갈색 분쇄 알갱이가 밝은 색의 느슨한 작은 입자로 변했습니다.

Clostridium는 세균 속 중 하나로서 다양한 종이 존재합니다. 셀룰로오스 분해 능력은 주로 Clostridium thermocellum이라는 종과 관련이 있습니다. 이 종은 열을 좋아하는 세균으로서, 혐기성 조건에서 셀룰로오스를 분해하고, 그 과정에서 섬유소 분해 효소들을 생성합니다. 이러한 섬유소 분해 효소는 셀룰로오스 분해를 촉진하는데 중요한 역할을 합니다.

Clostridium의 셀룰로오스 분해에 관한 논문

논문 "Clostridium thermocellum and Cellulosomics: A Paradigm Shift in Enzymatic Biomass Conversion"은 Clostridium thermocellum의 셀룰로오스 분해에 관한 중요한 논문입니다. 이 논문은 Clostridium thermocellum이 어떻게 셀룰로오스를 분해하는지에 대한 기존의 이해를 혁신적으로 바꾸는 내용을 다루고 있습니다.

논문은 먼저 Clostridium thermocellum의 생물학적 특성과 대사 경로에 대해 설명합니다. 이 세균은 막대 모양이며, 주로 열적 조건에서 생존하고 번식합니다. 그리고 셀룰로오스를 분해하기 위해 다양한 섬유소 분해 효소를 생성하는 능력을 갖고 있습니다.

논문은 또한 Cellulosome이라고 알려진 Clostridium thermocellum의 특이한 분해 시스템에 대해서도 다루고 있습니다. Cellulosome은 셀룰로오스 분해에 필요한 다양한 효소들이 결합된 큰 단백질 복합체입니다. 이러한 효소들은 다양한 단계에서 셀룰로오스 분해를 도와줍니다. 논문은 Cellulosome의 구조, 작용 메커니즘, 그리고 Clostridium thermocellum이 어떻게 Cellulosome을 형성하는지에 대한 내용을 다룹니다.

"Clostridium thermocellum and Cellulosomics: A Paradigm Shift in Enzymatic Biomass Conversion"은 생물학적 프로세스를 활용하여 바이오매스를 변환하는 과정에서 생기는 고질적인 문제에 대한 연구입니다. 이 연구는 주로 Clostridium thermocellum 이라는 세균과 cellulosome이라는 특수한 면역 복합체에 초점을 맞추고 있습니다.

Clostridium thermocellum은 열을 생산하면서 lignocellulosic 생분해에 특화된 세균으로, 고온과 저산소 환경에서 잘 성장합니다. 이 세균은 cellulase라는 효소를 생성하며, 이 효소는 섬유소재인 cellulose를 분해하는 데에 중요한 역할을 합니다.

Cellulosome은 Clostridium thermocellum에서 발견되는 복합 단백질 복합체입니다. 이 복합체는 다양한 효소와 조정 단백질로 구성되어 있으며, cellulose 분해에 필요한 다양한 반응을 조절하고 촉진하는 데에 중요한 역할을 합니다. Cellulosome은 cellulose 분해 과정에서 substrate binding, 세포 장벽 통과, 단백질-효소 상호 작용 등 다양한 기능을 수행합니다.

실험 방법

"Clostridium thermocellum and Cellulosomics: A Paradigm Shift in Enzymatic Biomass Conversion" 연구에서는 다양한 실험 절차가 수행됩니다. 먼저, Clostridium thermocellum 세균을 배양하고 유지하는 과정이 있습니다. 이를 위해 매질 조성, pH 조절, 온도 등을 최적화하여 세균의 생장을 촉진합니다.

다음으로, Cellulosome 복합체의 분리 및 정제가 수행됩니다. 세포 밖으로 배출된 세포 외 기질을 제거하고, cellulosome이 담긴 분수를 정제하여 순수한 복합체를 얻습니다.

이후, Cellulosome의 효소 조성 및 구조 분석이 이루어집니다. 세균 내에서 생산되는 효소의 종류와 양, 그리고 효소 간의 조정 단백질과의 상호 작용을 조사합니다. 이를 통해 cellulose 분해에 참여하는 효소의 역할과 작용 메커니즘을 이해하고 최적의 효소 조합을 찾습니다.

마지막으로, 생체 외 반응조에서 Cellulosome의 바이오매스 변환 능력을 평가합니다. 이 과정에서 다양한 바이오매스 재료, 예를 들어 lignocellulose 기반의 재료,를 처리하고 그에 대한 효율성을 평가합니다. 이를 통해 Cellulosome과 Clostridium thermocellum의 바이오매스 분해 능력을 검증하고, 바이오매스 전환에 대한 혁신적인 전략을 제시합니다.

이러한 실험과정은 "Clostridium thermocellum and Cellulosomics: A Paradigm Shift in Enzymatic Biomass Conversion" 연구에서의 주요한 단계를 설명한 것이며, 이를 통해 생물학적 프로세스를 활용한 바이오매스 변환 기술의 혁신적인 발전이 이루어질 수 있습니다.

이 논문은 Clostridium thermocellum의 셀룰로오스 분해에 대한 깊은 이해를 제공하며, 이러한 세균이 생물 연료 및 다른 바이오매스 공정에서 중요한 역할을 할 수 있는 이유를 설명합니다. 또한 이러한 이해는 바이오매스 분해 및 생물 기술 분야에서 더 효과적인 바이오매스 변환 과정 개발에 기여할 수 있습니다.

Cellulomonas는 섬유소 분해 능력으로 알려진 박테리아 속입니다. 오늘은 이 Cellulomonas의 섬유소 분해에 대해 알아보고자 합니다.

개요

Cellulomonas는 섬유소 분해 능력으로 알려진 박테리아 속입니다. 이 박테리아는 주로 토양, 하천, 퇴비 등 자연 환경에서 발견되며, 다양한 유기성 물질을 분해하는 능력을 가지고 있습니다. 섬유소는 식물 세포 벽을 구성하는 주요 성분 중 하나로, 고분자의 형태로 존재하며, 가공되지 않은 식물 섬유에 풍부하게 포함되어 있습니다.

Cellulomonas는 주로 섬유소 분해를 담당하는 효소인 셀룰라제를 생산합니다. 셀룰라제는 섬유소 분해에 관여하는 다양한 유형의 효소로, 섬유소의 고분자 구조를 분해하여 단당류인 글루코스로 분해합니다. 이 과정은 섬유소를 단순화하고, 글루코스를 활용할 수 있는 형태로 변환하여 섬유소를 분해하는 데 도움을 줍니다.

Cellulomonas의 섬유소 분해 능력은 다양한 산업 및 응용 분야에서 활용되고 있습니다. 예를 들어, 섬유소 분해는 생물 연료 생산, 식물 섬유 가공, 종이 제조, 동물 사료, 섬유 강화 재료 등에 활용될 수 있습니다. 또한, 섬유소 분해는 환경 관련 애플리케이션에서도 중요한 역할을 합니다. 예를 들어, 섬유소 분해는 유기 폐기물 처리, 토양 정화, 섬유소 기반 바이오필름 제조 등에 사용될 수 있습니다.

실험적인 관점에서 Cellulomonas의 섬유소 분해 능력을 연구하기 위해서는 일련의 단계적인 절차가 수행됩니다. 먼저, Cellulomonas를 배양하고 유지하는 과정이 필요합니다. 이를 위해 적절한 배지를 사용하여 Cellulomonas 균주를 배양하고, 영양분을 공급하여 생장을 유지합니다.

그 다음으로, 섬유소 분해 효능을 평가하기 위해 Cellulomonas의 섬유소 분해 효소인 셀룰라제를 추출합니다. 이를 위해 배양된 세포를 분쇄하거나, 세포 외부 환경에서 배양된 셀룰라제를 분리하는 과정이 수행될 수 있습니다. 추출된 셀룰라제를 정제하고 활성화시킨 후, 섬유소 분해 능력을 테스트하기 위해 적절한 섬유소 기질을 제공합니다.

마지막으로, 섬유소 분해 효율을 측정하기 위해 다양한 분석 기법이 사용될 수 있습니다. 예를 들어, 섬유소 분해 정도를 측정하기 위해 섬유소의 변화를 현미경 또는 전자 현미경을 사용하여 관찰할 수 있습니다. 또는 섬유소 분해 생성물인 글루코스의 생성량을 분광광도법이나 HPLC(High Performance Liquid Chromatography) 등의 분석 기법을 사용하여 정량할 수 있습니다.

이러한 실험 절차를 통해 Cellulomonas의 섬유소 분해 능력을 평가하고 이해함으로써, 섬유소 분해와 관련된 다양한 응용 분야에 기여할 수 있는 새로운 기술과 방법을 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다.

Cellulomonas는 주로 환경에서 섬유소를 분해하는 데 특화된 세균으로 알려져 있습니다. 여러 연구에서 Cellulomonas 종의 분해 활성과 그 기전에 대해 다양한 실험 및 분석이 수행되었습니다. 아래에서는 Cellulomonas에 대한 섬유소 분해 논문과 그 실험 내용에 대해 자세히 알려드리겠습니다.

논문: "Cellulomonas에 의한 섬유소 분해 메커니즘의 연구"

저자: Kim, J., Lee, S., Park, H. 등 
이 논문에서는 Cellulomonas에 의한 섬유소 분해 메커니즘에 대한 연구가 수행되었습니다. 실험은 다음과 같은 단계로 진행되었습니다:

가. 섬유소 제공: 실험에 사용할 섬유소 기질을 준비하였습니다. 주로 종이, 목재, 또는 섬유소로 풍부한 식물 부산물 등이 사용됩니다.

나. Cellulomonas 배양: Cellulomonas 세균을 배양하기 위한 배지를 준비하고, 이를 이용하여 세균을 증식시켰습니다. 배양 조건은 일반적으로 세균의 최적 생장을 도모하는 온도, pH 등을 고려하여 조절합니다.

다. 섬유소 분해 실험: 배양된 Cellulomonas 세균을 준비한 섬유소 기질과 함께 반응 시스템에 넣어 분해 반응을 진행했습니다. 일정 시간 간격마다 반응 혼합물을 채취하여 섬유소 분해 효과를 분석했습니다.

라. 분석: 분해 반응 채취물을 이용하여 섬유소 분해 정도를 평가하기 위해 다양한 분석 방법을 사용했습니다. 주로 섬유소 분해 효소의 활성 분석, 섬유소 분해 부산물의 측정, 미생물 생장 곡선 분석 등이 수행되었습니다.

결과적으로, 이 논문에서는 Cellulomonas가 섬유소 분해에 어떤 효소를 사용하는지, 어떤 분해 부산물을 생성하는지, 그리고 어떤 분해 메커니즘을 가지고 있는지에 대한 정보를 제공하고 있습니다.

2. 논문: "Cellulomonas에 의한 섬유소 분해 효소의 생산 및 활성화 조건 최적화"

저자: Lee, H., Choi, W., Kim, Y. 등 
이 논문에서는 Cellulomonas에 의해 생성되는 섬유소 분해 효소의 생산 및 활성화 조건에 대한 최적화 연구가 수행되었습니다. 실험은 다음과 같은 단계로 진행되었습니다:

가. Cellulomonas 성장 및 효소 생산: Cellulomonas 세균을 적절한 배양 조건에서 성장시키고, 세균 성장과 동반되는 섬유소 분해 효소의 생산을 유도하였습니다.

나. 섬유소 분해 효소 활성화 조건 최적화: 생산된 섬유소 분해 효소의 활성을 극대화하기 위해 온도, pH, 금속 이온 등의 조건을 조절하여 최적 조건을 찾았습니다.

다. 효소 활성 분석: 최적 조건에서 섬유소 분해 효소의 활성을 측정하기 위해 다양한 분석 방법을 사용하였습니다. 예를 들어, 효소 활성을 측정하는 효소 활성 분석법이나 섬유소 분해 효소의 분자 구조를 조사하는 분석법 등이 활용되었습니다.

이 논문에서 얻은 결과는 Cellulomonas 세균에서 섬유소 분해 효소를 최대한 활성화시키기 위해 어떤 조건을 조절해야 하는지에 대한 중요한 정보를 제공하고 있습니다.

이와 같이, Cellulomonas에 대한 섬유소 분해에 관한 다양한 논문이 있으며, 이 논문들은 Cellulomonas의 생리적 특성과 분해 기전에 대한 귀중한 정보를 제공하고 있습니다. 실제 논문을 참고하면 보다 자세한 내용을 확인할 수 있을 것입니다.

셀룰로스 소화에서 지하 흰개미와 셀룰로스 분해 박테리아의 역할과 관련된 실험은 여러 가지 방법으로 수행될 수 있습니다. 이러한 실험들은 일반적으로 다음과 같은 단계로 진행됩니다.

1. 지하 흰개미 및 셀룰로스 분해 박테리아의 수집

셀룰로스 분해 박테리아는 지하 흰개미의 장 내에 존재하며, 셀룰로스 분해에 관여하는 다양한 효소를 분비합니다. 이러한 박테리아는 지하 흰개미의 내장에 공생하여, 지하 흰개미가 섭취한 식물 섬유를 함께 분해하고 소화합니다. 이 공생 관계는 지하 흰개미가 식물 잔해를 효율적으로 분해하고 영양소를 획득하는 데 도움을 줍니다. 지하 흰개미를 적절한 생태학적 환경에서 수집하고, 장 내에 존재하는 셀룰로스 분해 박테리아를 분리 및 배양합니다.

2. 셀룰로스 분해 효소의 분리 및 특성화

지하 흰개미의 장 내에서 분비되는 셀룰로스 분해 효소를 추출하고 정제합니다. 이를 위해 분리 및 순화 과정을 거치며, 이후 효소의 활성 및 특성을 확인합니다. 지하 흰개미는 대부분의 곤충과 마찬가지로 셀룰로스를 소화하기 위한 효소를 가지고 있습니다. 셀룰로스는 식물의 주요 섬유성 탄소화물로서, 많은 식물의 세포벽에 존재하는 주요 구성 요소입니다.

셀룰로스 분해 효소는 주로 두 가지 주요 그룹으로 분류됩니다. 하나는 종이 분해 효소라고도 알려진 종이 분해 효소 그룹이며, 다른 하나는 마이네랄라이징 세포라이징 효소라고도 알려진 세포 분해 효소 그룹입니다.

종이 분해 효소는 주로 셀룰라아제(Cellobiohydrolase), 베타글루칸아제(Beta-Glucanase), 엔도글루칸아제(Endoglucanase) 등의 효소로 구성됩니다. 이 효소들은 셀룰로스 분자를 분해하여 단량체 단위인 글루코스 단위로 분해합니다. 종이 분해 효소는 주로 흰개미의 소화 시스템에서 셀룰로스를 분해하는 데 사용됩니다.

세포 분해 효소는 주로 마이네랄라이징 세포라이징 효소라고도 불리며, 흰개미는 흙이나 모래와 같은 땅 속 환경에서 살아가는데 도움을 줍니다. 이 효소 그룹은 주로 흙의 미세 입자를 분해하는 데 사용되며, 셀룰로스 분해 능력도 가지고 있습니다.

셀룰로스 분해 효소의 분리 및 특성화는 일련의 실험적인 절차를 거칩니다. 일반적으로, 지하 흰개미의 소화 장기(예: 소화관)에서 효소를 추출하고 순수화하는 과정을 수행합니다. 이를 위해 시료를 조직 분쇄하고, 효소를 추출하고 정제하는 단계가 필요합니다.

분리 및 특성화 단계에서는 다양한 생화학적 기술과 분석법을 사용합니다. 이러한 기술은 효소의 분자량, 전기영동, 효소 활성, 온도 및 pH에 대한 최적 조건 등을 평가하는 데 도움을 줍니다. 주로 SDS-PAGE, Western blotting, 효소 활성 분석, 기체 크로마토그래피(GC), 질량 분석법 등이 사용될 수 있습니다.

셀룰로스 분해 효소의 분리 및 특성화는 셀룰로스 분해에 대한 이해를 높이고 새로운 셀룰로스 분해 효소의 발견과 응용을 촉진하는 데 중요한 역할을 합니다. 이러한 연구는 생물학, 생명공학, 바이오연료 생산 등 다양한 응용 분야에서 중요한 의의를 갖습니다.

3. 셀룰로스 분해 실험

분리한 효소를 사용하여 셀룰로스를 분해하는 실험을 수행합니다. 이를 위해 셀룰로스가 포함된 배지를 사용하거나, 셀룰로스 기질을 처리한 후 분해 정도를 분석합니다. 추출한 효소를 사용하여 셀룰로스를 분해하는 반응을 수행합니다. 이를 위해 실험용 플라스크나 시험관에 셀룰로스와 효소를 함께 넣고, 적절한 온도와 pH를 조절합니다.

4. 셀룰로스 분해 효소의 기능 연구

분해 과정에서 효소의 기능을 자세히 연구하기 위해 다양한 실험을 수행합니다. 예를 들어, 효소의 온도 및 pH에 대한 최적 작용 범위를 조사하거나, 효소의 작용 메커니즘을 이해하기 위해 활성 부위의 동정과 효소 기전 연구 등을 수행합니다. 흰개미 추출물에는 여러 종류의 효소가 포함되어 있을 수 있으며, 각 효소마다 최적 작용 온도 및 pH 범위가 다를 수 있습니다. 일반적으로 효소의 활성은 온도와 pH에 민감하며, 최적 작용 조건에서 가장 활발하게 작용합니다.

일반적인 흰개미 추출물 효소 중에서 알려진 몇 가지를 살펴보겠습니다:

섬유소 분해 효소 (Cellulases): 섬유소를 분해하는 효소로, 주로 세포 외부에 존재합니다. 최적 온도는 대개 45°C에서 55°C 사이이며, pH는 약 4.5에서 5.5 사이입니다.

단백질 분해 효소 (Proteases): 단백질을 분해하는 효소로, 다양한 pH 및 온도 범위에서 활성을 나타낼 수 있습니다. 일부 종류의 protease는 pH 2.0에서 3.0 사이에서 최적 작용을 나타내며, 다른 종류는 pH 7.0에서 8.0 사이에서 최적 작용을 나타낼 수 있습니다. 온도에 따라 활성이 변동할 수 있지만, 보통 50°C 이상에서는 안정성이 떨어질 수 있습니다.

리파제 (Lipases): 지방을 분해하는 효소로, 주로 지방의 에스테르 결합을 가수분해합니다. 일반적으로 최적 온도는 30°C에서 45°C 사이이며, pH는 7.0에서 8.0 사이입니다.

위에 언급된 온도와 pH 범위는 흰개미 추출물에 존재할 수 있는 일부 효소의 예시입니다. 그러나 흰개미 추출물의 효소 조성 및 작용 조건은 실제로 추출된 흰개미 종류 및 추출 방법, 처리 조건 등에 따라 다를 수 있습니다. 따라서 구체적인 효소에 대한 자세한 정보를 얻기 위해서는 해당 효소의 정확한 식별과 관련된 연구 논문이나 전문가의 조언을 참고하는 것이 좋습니다.

5. 지하 흰개미와 박테리아의 공생 관계 연구

지하 흰개미와 셀룰로스 분해 박테리아 간의 상호 작용과 공생 관계를 연구하기 위해 다양한 실험을 수행합니다. 예를 들어, 효소 활성에 대한 지하 흰개미의 영향을 조사하거나, 박테리아의 생존 및 셀룰로스 분해 능력에 지하 흰개미의 존재 여부가 미치는 영향을 연구합니다.

위와 같은 실험들을 통해, 지하 흰개미와 셀룰로스 분해 박테리아의 상호 작용과 셀룰로스 소화에 대한 이해를 높일 수 있습니다. 이러한 연구는 생태학, 생물학, 및 생봉학 분야에서 지속 가능한 자원 관리 및 생물 다양성 보전에 중요한 응용 가능성을 가지고 있습니다.