해양 미생물의 섬유소 분해 효소: 자원, 생산, 생화학적 특성 및 혈전 용해성

 

심혈관 질환(CVD)은 인간에 비해 기대 수명을 감소시키며 세계인의 건강을 위협하고 있습니다. 혈전증은 CVD의 주요 원인 중 하나이며 피브린 응고 형성을 그 특징으로 합니다. 최근 미생물 혈전용해효소는 그 특이적인 특징으로 인해 기존의 혈전용해제보다 혈전증 치료에 많은 관심을 받고 있습니다. 박테리아 및 미세조류를 포함한 해양 미생물은 약리학적 특성이 개선되고 부작용이 적은 혈전용해 효소를 생산할 수 있는 상당한 능력을 가지고 있으므로 이러한 효소의 대규모 생산을 위한 유망한 후보로 간주됩니다. 해양 진균 유래 효소의 섬유소 분해 가능성을 평가한 연구는 없습니다. 현재 리뷰는 지금까지 확인된 해양 미생물로부터의 섬유소 분해 생체 촉매의 분리 소스, 생산, 특징 및 혈전 용해 가능성에 관한 개요를 제시합니다.

1. 서론

혈전증은 급성 심근 경색, 허혈성 심장 질환, 판막 심장 질환, 말초 혈관 질환, 부정맥, 고혈압 및 뇌졸중을 포함한 심혈관 질환(CVD)의 주요 원인이며 전 세계적으로 주요 사망 원인입니다. 인구 증가, 고령화 및 생활 방식의 변화로 인해 혈전성 질환이 더욱 심각한 문제가 되었습니다. 트롬빈은 피브리노겐을 혈전이나 혈전의 핵심 구성 요소인 피브린으로 전환하는 것을 촉매합니다. CVD의 공중 보건 데이터는 세계 보건 기구(WHO)에 의해 잘 문서화되어 있습니다. WHO의 경우 2016년에만 CVD로 인해 전 세계적으로 1,790만 명이 사망했으며, 2030년에는 약 2,330만 명이 영향을 받을 것으로 예측됩니다. 따라서 CVD는 경제적 부담뿐만 아니라 세계적인 건강 문제로 대두되고 있습니다. 혈전증은 CVD의 가장 중요한 원인 중 하나로 알려져 있으며 피브린 응고의 형성을 특징으로 합니다. 정상적인 생리적 조건에서는 피브린의 형성과 분해에 항상성 균형이 있습니다. 그러나 일부 병리학 적 장애에서는 균형이 맞지 않아 섬유소가 응집되어 혈전증이 발생합니다. 혈전의 빠른 용해와 혈류의 재확립은 혈전성 질환을 효과적으로 치료하는 데 중요합니다.섬유소용해 효소는 혈전증의 임상 치료를 위한 가장 유망한 약물로 간주됩니다. 이들은 플라스미노겐 활성화제(예: 조직형 플라스미노겐 활성화제 t-PA, 유로키나제 플라스미노겐 활성화제 u-PA, 스트렙토키나제 및 플라스민 유사(예: 나토키나제) 및 룸브로키나제 섬유소분해 효소)로서의 기능에 따라 그룹화할 수 있습니다.플라스미노겐 활성화제는 플라스민 생산에 의해 피브린을 가수분해하며, 후자는 피브린 혈전을 직접 분해할 수 있습니다. 현재까지 재조합 조직형 플라스미노겐 활성제(rt-PA)는 FDA 승인을 받은 유일한 상업용 혈전용해제입니다. 그러나 임상 데이터에 따르면 잠재적인 신경 독성과 함께 짧은 시간 창(time window)이 나타났으며 출혈로 인해 짧은 반감기와 더불어 t-PA 치료 실패 가능성이 발생했습니다. 예를 들어, 높은 비용과 바람직하지 않은 부작용으로 인해 연구자들은 비용 효율적이고 안전한 혈전용해제를 탐색하게 되었습니다.지난 수십 년 동안 뱀, 지렁이, 곤충, 식물, 버섯, 미생물 및 발효 식품과 같은 천연 자원의 많은 섬유소 분해 효소, 청국장, Tempeh 등이 확인되고 연구되었다. 이러한 효소가 다양한 출처에서 특성화되었지만 미생물 섬유소 분해 효소는 향상된 특이성, 낮은 생산 비용, 비교적 높은 수율 및 재조합 DNA 기술 및 단백질 공학적 접근법에 의해 유전적으로 변형될 가능성이 있습니다. 해양 생태계는 중요한 치료 대사 산물, 특히 효소를 생산하는 미생물의 저장소 역할을 하지만현재까지 대부분 미개척 상태로 남아 있습니다. 해양 환경의 광범위한 생물 다양성으로 인해 해양 미생물은 약리학적 특성을 개선하고 부작용을 줄일 수 있는 생명공학 개발을 위한 다양한 효소를 제공할 수 있습니다. 이러한 효소의 독성을 평가하기 위해 다른 많은 연구 연구가 수행되어야 하지만, 인간에게 적용했을 때 최소한의 부작용이 있다는 증거가 있습니다. 이러한 관점에서 미생물 섬유소용해 효소의 가능한 알레르기 특성에 특별한 주의를 기울여야 합니다. 따라서 해양 공급원의 섬유소 분해 효소는 이 수십 년 동안 임상적 관심을 모았습니다.

2. 섬유소 용해 효소 공급원으로서의 해양 미생물

해양 미생물은 섬유소 분해 효소의 중요한 자원입니다. 이러한 효소는 건강 증진 및 기능 식품 사용에 잠재적인 효능을 가지고 있으며, 이를 적용하면 심혈관 질환을 효과적으로 예방할 수 있습니다. 바실러스속으로 분류되는 해양미생물은 혈전용해효소 생산에 가장 귀중한 자원으로 여겨지는 반면, 해양진균 유래의 혈전용해능을 평가한 연구는 전무합니다. 효소. 섬유소 분해 효소의 촉매 활성은 화학적 변형 및 돌연변이 선택에 의해 향상될 수 있다는 점에 유의해야 합니다.

3. 섬유소용해 효소의 정제

효소 정제의 주요 목적은 다른 오염 단백질과 다른 방해 생체 분자를 제거하는 것입니다. 또한 효소 정제를 통해 정제된 효소의 구조적 및 기능적 특징에 대한 통찰력을 얻을 수 있을 뿐만 아니라 응용 분야를 예측할 수 있습니다. 필요한 순도 수준은 단백질이 사용되는 목적에 따라 다릅니다. 치료 용도로 간주되는 경우 효소는 더 높은 수준의 순도를 가져야 하며 여러 후속 정제 단계를 거쳐 처리되어야 합니다.
현재 해양 미생물에서 섬유소 분해 효소를 분리하고 정제하기 위해 여러 가지 접근 방식이 사용되었습니다. 이러한 접근법은 첫 번째 단계로 수성 완충액으로 박테리아를 추출한 다음 아세톤 또는 황산암모늄을 사용한 농축/침전 단계와 투석을 포함했습니다. 황산암모늄은 저가의 시약이고 물에 잘 녹으며 단백질과 효소를 안정화시킬 수 있기 때문에 단백질 침전에 황산암모늄을 사용하는 것이 바람직합니다. 다른 크로마토그래피 단계를 사용하여 추가 정제를 수행합니다.

4. 해양미생물 섬유소분해효소의 생화학적 특성 규명

4.1. 혈전용해효소의 물리화학적 성질

4.1.1. pH, 온도, 억제제 및 이온의 분자량 및 영향

분자량, 최적 pH 및 온도를 포함하여 해양 미생물 섬유소 분해 효소의 중요한 물리화학적 특성에 대한 자세한 개요를 제공합니다. 정제된 해양 미생물 섬유소분해 효소의 분자량은 방선균(Streptomyces lucitanus)의 낮은 21kDa에서 시아노박테리움(Arthrospira platensis)의 높은 72kDa까지 다양합니다. 대부분의 해양 미생물 섬유소분해 효소는 중성에서 알칼리성 값으로 변동하는 최적의 pH를 가지며, 범위는 6에서 8까지입니다. 해양 미생물 섬유소 분해 효소의 최적 온도 범위는 33°C(Streptomyces radiopugnans VITSD8) ~ 60°C(Bacillus flexus)입니다. 또한, 일부 연구는 화학 시약 및 금속 이온이 이러한 새로운 섬유소 분해 효소에 의한 촉매 작용을 묘사하고 특성화하는 효과에 초점을 맞췄습니다. 실제로, 활성 부위의 특정 화학적 기능에 따라 섬유소분해 효소는 메탈로프로테아제, 세린 프로테아제 및 세린 메탈로프로테아제로 분류될 수 있습니다. 대부분의 Bacillus spp. serine protease에 속하며 PMSF(Phenyl Methyl Sulphonyl Fluoride)에 의해 활성이 억제된다. 촉매 부위의 세린 아미노산에서 활성 그룹(OH)을 갖는 단백질 분해 효소는 세린 프로테아제로 인식됩니다. 촉매 활성이 억제되는 동안 PMSF의 설포닐 그룹은 활성 부위의 세린 OH 그룹에 비가역적으로 결합합니다. 또한 Pseudomonas aeruginosa KU1의 메탈로프로테아제는 일부 금속 이온, 예를 들어 Mn2+, Fe2+ 및 Zn2+에 의해 억제됩니다. 유사하게, 세린 메탈로프로테아제에 속하는 섬유소용해 효소의 활성은 Serratia marcescens subsp. sakuensi, Arthrospira platensis 및 Chlorella vulgaris의 효소에 대한 Fe2+; 따라서 이들의 촉매는 EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 및 EGTA(에틸렌 글리콜-비스(β-아미노에틸 에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산)와 같은 킬레이트제에 의해 억제되었습니다.

4.1.2. 피브리노겐 용해 활동 섬유소 용해 효소의 효능은 플라스미노겐을 간접적으로 활성화하는 것과 섬유소에 직접적으로 작용하는 두 가지 다른 메커니즘에 의해 결정됩니다. 해양 바실러스 효소는 일반적으로 섬유소 형성 또는 섬유소 분해 생성물에 직접적으로 작용한다. Bacillus velezensis BS2에서 분리된 AprEBS2는 높은 Aα 섬유소 용해 활성을 나타냈고, 중간 정도의 Bβ 및 약한 γ 사슬 섬유소 용해가 나타났습니다. 그럼에도 불구하고 Bacillus pumilus BS15와 Bacillus subtilis JS2의 섬유소 분해 효소는 γ-사슬 용해를 나타내지 않았습니다. Bacillus licheniformis KJ-31은 Aα fibrinogen lytic 활성이 높은 fibrinolytic enzyme만을 생산하는 미생물 중 하나입니다.

4.2. 해양 미생물 섬유소 분해 효소의 아미드 분해 및 동역학 특성

미생물 섬유소분해 효소는 아미드분해(또는 전응고제) 활성을 나타내며, 이는 다양한 합성 발색 기질을 사용하여 평가됩니다. 연구된 효소의 대부분은 N-Succ-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA에 대해 높은 특이성을 보여 세린 프로테아제로 분류합니다. 또한 미카엘리스 상수, 반응 속도(Vmax) 및 회전율(kcat)을 포함한 운동 매개변수는 특정 기질에 대한 효소의 특이성과 친화성을 이해하는 데 도움이 됩니다.

5. 해양미생물 섬유소분해효소 생산

5.1. 유전자 조작 균주의 구축

유전자 클로닝, 돌연변이 유발 및 재조합 DNA 기술은 박테리아 숙주에서 섬유소 분해 효소의 과발현과 촉매 특성을 조작하기 위해 사용되었습니다. 예를 들어, Yao와 동료들(2018)은 Bacillus pumilus BS15에서 재조합 섬유소분해 효소의 상당히 높은 섬유소분해 활성을 달성했습니다. 또 다른 예에서 Che와 동료(2020)는 유전자 투여량, 코돈 최적화 및 공정 최적화를 사용하여 해양 Bacillus subtilis에서 분리한 섬유소 용해 효소(fibase)의 높은 발현 및 분비를 달성했습니다. 따라서 배양 배지 최적화와 재조합 DNA 기술의 조합이 효소 역가를 증가시키기 위해 효과적으로 사용되었습니다.

5.2. 발효 접근법

효소의 생산 비용은 산업 분야에서 도전적인 요소 중 하나입니다. 미생물 섬유소용해 효소의 상업적 획득 가능성은 가능한 최저 비용으로 높은 수율을 필요로 합니다. 따라서 발효 접근법은 효소 생산 비용을 줄이는 데 매우 뛰어납니다. 예를 들어, 선택된 침지 발효는 생산 수율과 효율성을 향상시킬 수 있습니다. 유사하게 Anusree와 동료(2020)는 수중 발효를 사용하여 해양 환경에서 얻은 세균 Serratia rubidaea KUAS001에서 섬유소 용해 효소의 발현을 개선할 수 있었습니다. 또한 Pan과 동료들(2019)은 Bacillus subtilis D21-8에서 효소의 생산 비용을 최소화하기 위해 비멸균 침지 발효의 활용을 보여주었습니다. 또한 Box–Behnken 설계, 2단계 완전 요인 설계, 반응 표면 방법론, Plackett-Burman 설계, 1인자 실험, L18-직교 배열 방법 및 중앙 복합 실험 설계는 물리-화학적 최적화에 유용한 접근 방식입니다. 섬유소 분해 효소 생산을 위한 매개변수. 예를 들어 Farraj와 동료(2020)는 2단계 완전 요인 설계 및 반응 표면 방법론을 적용하여 고체 발효 공정을 사용하여 Bacillus flexus에서 분리된 섬유소 분해 효소의 발현을 증가시킬 수 있었습니다. 그들은 최대 3.5배까지 향상된 섬유소 분해 효소 생산을 입증했습니다

6. 해양미생물 섬유소용해효소의 혈전용해 활성

CVD의 효과적인 치료는 미생물 섬유소용해 효소와 같은 혈전 용해제에 의존합니다. 미생물은 고대부터 섬유소 분해 효소를 생산하는 데 활용되었습니다. 지난 수십 년 동안 연구원들은 해양 미생물에서 섬유소 분해 효소 생산에 대해 집중적으로 보고했습니다. 예를 들어, Hwang et al. (2007)은 BpKJ-31이 출혈을 유발하지 않는 건강 증진 생체 재료로서 유망한 후보임을 보여주었다. 해양 Serratia marcescens의 정제된 섬유소 용해 효소에 의한 혈전 용해에 대한 시험관 내 연구 결과 38%의 혈전 용해가 나타났으며 이는 streptokinase 및 heparin에 의해 보고된 것보다 훨씬 높았습니다. 또한 Gowthami 등이 수행한 연구(2021)에서 박테리아 균주 GPJ3에서 분리한 섬유소 용해 효소는 시험관 내 조건에서 완전히 혈전을 분해하고 대식세포의 상처 치유에 강력한 활성을 나타냈습니다. 해양 Bacillus subtilis의 재조합 fibase의 특성은 혈전증의 치료 및/또는 예방을 위한 잠재적인 사용을 제안합니다. 또한 Pseudomonas aeruginosa KU1의 새로운 섬유소용해 프로테아제인 정제된 PEKU1은 CVD 치료제로 개발될 수 있는 뛰어난 잠재력을 가지고 있습니다.

7. 결론

과학계는 이미 혈전용해 효소에 대한 모든 이용 가능한 정보를 효과적으로 활용하고 있습니다. 미래 전망으로서 커뮤니티는 특히 해양 환경에서 섬유소 분해 효소의 새로운 공급원을 탐색하는 데 초점을 맞춰야 합니다. 해양 미생물 섬유소 용해 효소는 CVD를 예방하거나 치료하기 위한 표적 약물로서 엄청난 치료 잠재력을 가지고 있습니다. 이러한 효소에 대한 광범위한 연구는 심장 질환 관리를 위한 비용 효과적이고 안전하며 예방적인 솔루션을 개발할 것을 약속합니다. 혈전용해제를 개발하고 개선하는 새로운 추세는 피브린 특이성과 결합 효능을 강화하는 것입니다. 경제적이고 효과적이며 안전한 약물을 설계하려면 생산 매개변수의 추가 최적화도 필요합니다. 따라서 혈전용해제로 해양 미생물 섬유소용해 효소를 사용하는 것은 미래에 상서롭고 안전한 선택이 될 수 있습니다.