탄소 중립성에 대한 요구가 증가함에 따라 저탄소 생산의 새로운 기술과 모드가 개발되었습니다. 저비용 재생 가능 자원을 보다 가치 있는 화학 물질로 전환하기 위한 미생물학의 활용이 특히 중요합니다. 그래서 셀룰로오스 분해 세균인 Bacillus subtilis 의 능력을 조사한 논문을 소개할까 합니다.
스위치그래스 리그노셀룰로오스 분해에서 1AJ3. 균주를 37℃에서 5일 동안 배양한 뒤의 셀룰로오스, 자일란 및 산불용성 리그닌 분해율은 각각 16.13, 14.24 및 13.91%이었습니다. 가스 크로마토그래피-질량 분석법(GC-MS) 분석 및 전계 방출 주사 전자 현미경(FE-SEM)은 스위치그래스의 리그닌과 표면이 박테리아 균주와 함께 배양된 후 분해되었음을 나타냅니다. 균주 1AJ3은 대부분의 셀룰라아제의 최적 온도(50°C) 조건을 만족시키는 60°C 이하에서 잘 자랄 수 있습니다. 후속 결과는 산-열 인큐베이션 조건이 B. subtilis 에 의해 분해되는 광범위한 셀룰로오스 바이오매스에서 환원당 함량을 증가시킨다는 것을 강조합니다. 더 많은 환원당을 얻기 위해 올리고당으로의 셀룰로오스 분해의 마지막 단계에서 중요한 역할을 하는 β-글리코시드 가수분해효소에 집중했습니다. β-글리코시드 가수분해효소(Bgl-16A)는 대장균에서 클로닝 및 발현을 특징으로 했습니다. Bgl-16A는 365.29 ± 10.43 U/mg의 효소 활성을 가지며, 효소의 작용 방식은 분자 도킹으로 설명됩니다. 또한, Bgl-16A의 온도(50°C)에 대한 결정적인 영향은 산열 조건에서 균주에 의한 바이오매스의 고효율 분해를 설명합니다. 잠재적인 응용 측면에서 균주와 재조합 효소 모두 커피 찌꺼기가 적합하고 가치 있는 기질이 될 것임을 보여주었습니다. 이 연구는 B. subtilis 에 의한 셀룰로오스 분해에 대한 새로운 이해를 제공합니다. 효소 작용 방식과 셀룰라아제에 의한 최적 온도 제한이 모두 분해에 영향을 줄 수 있음을 알 수 있습니다. 또한 녹색제조업의 산업생산에 있어서 독특한 우위 활용에 대한 새로운 시각을 제시하였습니다.
서론
에너지 전환은 개발도상국의 환경, 기후 및 경제에 도움이 되는 탄소 중립성을 향한 핵심 전환입니다. 에너지 전환과 저탄소 생산을 달성하기 위해 가장 중요한 부분은 화석 연료에서 재생 에너지원으로 전환하는 것입니다. 식물 기반 리그노셀룰로스 물질은 다중 탄소 성분과 그 파생물이 설탕, 알코올, 지질 및 푸르푸랄과 같은 추가 합성을 위해 고체 또는 액체 기본 물질로 변형될 수 있기 때문에 바이오 연료 및 생물전환 제품의 주요 기질이 되었습니다. 바이오 연료 산업은 바이오매스 리그노셀룰로스의 추가 활용을 위한 중요한 영역입니다. 여러 식물, 작물, 미세조류를 포함한 바이오매스, 공정 부산물 또는 폐기물은 지구상에서 가장 풍부한 면적을 가지고 있으며 바이오연료의 주요 공급원료가 되는 재생 가능한 특성을 가지고 있습니다. 높은 에너지 매장량과 낮은 식재 비용으로 인해 바이오연료 생산에 적합한 스위치그래스는 바이오매스 분해 연구에 널리 사용되었습니다, 액체 연료 평가, 분자 육종 연구, 더욱이, 밀짚 및 옥수수 짚과 같이 쉽게 버려지는 다른 셀룰로스 물질은 분해를 위한 셀룰로스 기질이 될 수 있습니다.
리그노셀룰로오스를 환원당으로 전환하는 당화는 항상 바이오연료 전환율과 수율의 핵심 공정 제한 요소입니다. 리그노셀룰로오스 구조는 특히 헤미셀룰로오스와 리그닌이 존재할 때 셀룰로오스-셀룰라아제의 직접적인 상호작용을 방지하기 때문에 가수분해하기 어렵게 만듭니다. 전처리는 리그노셀룰로오스의 거친 구조를 약화시켜 셀룰로오스를 환원당에 더 쉽게 접근할 수 있도록 합니다. 물리적, 화학적 및 생물학적을 포함한 전처리 방법의 조합은 산업 공정에서 일반적으로 사용됩니다. 생물학적 방법은 잠재적인 분해 능력 때문에 지난 몇 년 동안 더 많은 관심을 받았습니다. 박테리아는 풍부한 효소 시스템, 빠른 성장, 내압성 및 유전자 조작의 용이성으로 인해 더 많은 관심을 끌었습니다. 더욱이, 다양한 유형의 셀룰로오스는 박테리아가 다양한 셀룰라아제를 생성하도록 유도하여 미생물 리그노셀룰로오스를 특정 소스로 만듭니다. 따라서, 광범위하게 바이오매스 기질 분해된 박테리아가 바람직할 것이다.
셀룰라아제는 셀룰로스 분해를 위한 효소 시스템으로 구성되며, 작용 모드에 따라 엔도-셀룰라아제, 엑소-셀룰라아제 및 베타-글리코시드 가수분해 효소의 세 가지 클래스로 나뉩니다 . 엔도 셀룰라아제와 엑소 셀룰라아제 모두 긴 셀룰로스 사슬을 짧은 사슬 또는 올리고당으로 가수분해할 수 있습니다. 차이점은 endo-cellulase는 무작위로 가수분해되는 반면 exo-cellulase는 셀룰로오스 사슬의 끝에서만 cellobiose를 가수분해할 수 있다는 것입니다. 그 후, 베타-글리코시드 가수분해효소는 올리고당을 단당류로 가수분해하여 추가 부가가치 제품을 위한 재료를 제공합니다. 따라서 베타-글리코시드 가수분해효소는 셀룰로오스를 단당류로 완전히 가수분해하는 데 중요한 역할을 하며 속도 제한 단계이기도 합니다. 또한 베타-글리코시드 가수분해효소는 식품, 사료 및 바이오연료 산업과 같은 다양한 생분해 과정에 영향을 미칩니다. 박테리아는 배당체 가수분해효소의 풍부한 공급원이며, 특히 Bacillus 종은 산업 분야에서 엄청난 응용 가능성을 보여주었습니다.
우리의 이전 연구에서 셀룰로오스 분해 박테리아인 B. subtilis1AJ3는 친링 산맥의 썩은 숲에서 격리되었습니다. 이 균주는 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨과 Avicel을 탄소원으로 사용하여 성장할 수 있으며 이론적으로 바이오매스에서 셀룰로오스를 분해할 수 있습니다. 이 연구는 1AJ3 균주에 의한 바이오매스의 특정 분해 능력을 평가했습니다. 그러면 균이 자라는 온도가 셀룰라아제 활성을 위한 최적의 온도와 일치하지 않기 때문에 배양 온도 인자의 증가가 당화율을 향상시키는 것으로 생각되었다. 셀룰로오스 분해 과정 중 제한 요인을 더 잘 이해하기 위해 올리고당을 단당류로 가수분해하는 마지막 단계의 가수분해 효소인 베타-글리코시드 가수분해 효소에 초점을 맞췄습니다. 균주 B. subtilis 의 재조합 베타-글리코시드 가수분해효소1AJ3은 대장균 BL21(DE3) 에서 클로닝 및 발현을 특징으로 합니다 . 또한 Bgl-16A의 이론적인 기작을 기질 분자 도킹을 통해 연구하였다. 우리의 결과는 베타-글리코시드 가수분해효소가 가수분해 활성 작용 모드와 엄격한 작용 온도로 인해 B. subtilis 균주 1AJ3 에 의한 셀룰로오스 분해에 대한 제한 요인이 될 것임을 보여주었습니다 . 또한 우리는 커피 찌꺼기가 박테리아 균주나 베타-글리코시드 가수분해 효소가 분해할 수 있는 바이오 연료의 잠재적인 기질이 될 수 있음을 발견했습니다.
재료 및 방법
균주, 플라스미드 및 배지
Bacillus subtilis 1AJ3(GenBank No. MG062801)은 Qinling 산의 썩은 나무에서 분리되었습니다. 박테리아는 LB 배지(NaCl 10g/L, 트립톤 10g/L, 효모 추출물 분말 5g/L), 스위치그래스 단일 탄소원 배지(7%), 이온성 액체(NH 4 ) 2 SO 에서 성장 시켰다 . pH 7.2 또는 5.6에서 4 2.0 g/L, MgSO 4 7H 2 O 0.5 g/L 및 K 2 HPO 4 1.0 g/L. 배지는 사용 전 121°C에서 20분간 멸균하였습니다.
플라스미드 pET-28a를 사용하여 재조합 발현 벡터를 구성하였다. 대장균 BL21(DE3)을 발현 숙주로 사용하였다. 제한 엔도뉴클레아제 Nco I 및 Xho I은 Takara에서 구입했습니다. DNA 추출 키트, 플라스미드 추출 키트 및 PCR 정제 키트는 Omega Bio-Tek, Inc.에서 구입했습니다. Primer 합성 및 시퀀싱은 Sangon Biotech Inc.(Shanghai)에 위탁했습니다.
환원당 함량 및 셀룰라아제 활성 측정
배양 배지에서 감소된 당 함량은 DNS 방법에 의해 결정되었다. CMCase 활성은 이전에 기술된 바와 같이 분석했습니다. CMCase의 1단위(U)는 특정 pH와 온도에서 1분 동안 1μmol의 포도당을 생성하는 효소의 양을 의미합니다.
재조합 베타-글리코시드 가수분해효소 활성은 기질로서 p-NPG(4-Nitrophenyl β- D -galactopyranoside, CAS: 3150-24-1)를 사용하여 50°C에서 10분 동안 p-NP( p -Nitrophenol, CAS : 100-02-7)을 기준으로 합니다. 베타-글리코시드 가수분해효소의 1단위(U)는 분당 1μmol의 p-NP를 방출하는 데 필요한 효소의 양으로 정의되었습니다.
균주 Bacillus subtilis 1AJ3 에 의한 스위치그래스의 가수분해 및 분석
Bacillus subtilis 1AJ3는 CMC-Na 액체 배지에서 37°C, 150 rpm으로 48시간 동안 성장했습니다. 박테리아를 4°C에서 10분 동안 10,000 x g 에서 원심분리하여 수집 하고 OD 600nm 1.0 에서 멸균 배양 배지 이온성 액체에 재현탁했습니다 . 10%의 세포를 스위치그래스 배지로 옮기고 37°C, 150rpm에서 5일 동안 배양하여 접종을 수행했습니다. pH를 매일 모니터링하였다. 블랭크는 박테리아가 없는 접종 배지로 설정되었습니다.
분석을 위해 배양액을 배양액과 불용성 잔류물의 두 가지로 나누었습니다. 배양액은 12,000× g 에서 원심분리하여 배양액에서 분리하였다 . 스위치그래스 잔류물을 샌드 코어 연료에서 여과하고 증류수로 헹구고 60°C에서 밤새 오븐 건조했습니다. 배양액의 총 환원당 함량은 앞서 기술한 바와 같이 DNS에 의해 결정되었다. 배양액 및 스위치그래스 잔사의 셀룰로오스 조성 분석은 산가수분해를 이용하여 수행하였습니다. NREL(National Renewable Energy Laboratory) 지침에 따라 분해된 저분자당을 검출하고 배양액 및 건조 스위치그래스 잔류물에서 셀룰로오스 및 자일란 분해 수준을 계산합니다. 결과는 세 번의 독립적인 실험의 "평균 ± 표준 편차"로 표시됩니다.
전계 방출 주사 전자 현미경 및 가스 크로마토그래피-질량 분석 분석
B. subtilis 1AJ3 와 함께 5일 동안 배양한 분해된 스위치그래스 시료와 블랭크 시료를 전계 방출 주사 전자 현미경(FE-SEM)으로 분석하여 박테리아에 의한 리그노셀룰로오스 가수분해를 가시화하였습니다 . 가스 크로마토그래피-질량(GC-MS) 분광법을 사용하여 박테리아에 의한 스위치그래스 리그노셀룰로오스 가수분해를 평가했습니다. FE-SEM 및 GC-MS는 이전에 설명한 대로 수행되었습니다. 대조군은 세균이 없는 처리였다. 보존 시간(RT)을 기반으로 NIST 라이브러리에 대해 벤젠 고리 화합물의 존재를 확인했습니다.
Bacillus subtilis 1AJ3 열안정성 및 다양한 셀룰로오스 재료에서의 응용
공업적 생산 및 효소 반응 공정시 고온이 필요하며 셀룰라아제 활성을 위한 최적의 온도는 50°C입니다. B. subtilis 1AJ3는 다른 온도에서 성장하도록 허용되었으며 가장 높은 허용 온도가 기록되었습니다. 간략히 설명하면, B. subtilis 1AJ3를 플레이트에 현탁액을 코팅하여 60, 80 및 100°C에서 2일 동안 배양했습니다. 플레이트(Congo-red를 포함하는 고체 배지) 상의 박테리아 콜로니 수 및 성장 진술은 24시간 및 48시간 후에 관찰될 것이다.
적합한 바이오매스 셀룰로오스 기질 B. subtilis 1AJ3를 식별하기 위해, 10가지 유형의 바이오매스 셀룰로오스 물질, 스위치그래스, 밀짚, 옥수수 줄기, 옥수수 속대, 왕겨, 사탕수수 줄기, 완두콩 짚, 생강 줄기 및 잎, 땅콩을 분해하는 박테리아의 능력 껍질과 커피 찌꺼기를 조사했습니다. 미가공 바이오매스 셀룰로오스를 분쇄하고 60℃에서 건조시킨 후 무게를 쟀다. 계량된 샘플을 100°C에서 2시간 동안 배양하고 오염을 최소화하기 위해 박테리아 현탁액에 첨가했습니다. 박테리아를 LB 배지에서 배양하고 세포를 10,000 x g 에서 10분 동안 4°C에서 원심분리하여 수집했습니다. 세포를 다른 pH에서 이온 액체를 사용하여 세척하고 추가 분석을 위해 OD 600nm = 1.0으로 재현탁했습니다.
이전에는 4.0의 초기 매체 pH가 더 높은 환원당 함량을 제공하는 것으로 나타났습니다. B. subtilis 1AJ3은 pH 4.0 및 80 ° C 성장 온도에 저항할 수 있었고 대부분의 셀룰라아제의 최적 온도가 50°C인 것을 고려하여 박테리아의 바이오매스 셀룰로스 분해를 두 가지 조건에서 평가했습니다. 조건 1: 초기 배지 pH 7.0, 37 °C, 72시간 동안 150rpm. 조건 2: 초기 배지 pH 4.0, 50℃, 150rpm에서 72시간. 분해 상태 및 환원당 함량을 평가하였다. 변형이 없는 처리는 공란으로 설정하였다.
대장균 에서 재조합 Bgl-16A의 발현 및 정제
B. subtilis 1AJ3의 베타-글리코시드 가수분해효소 유전자 bgl -16A 는 1차 연구에 따라 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 통해 게놈 DNA에서 증폭되었습니다( Ma et al., 2020c ). 이중 분해( Nco I 및 Xho I) 및 pET-28a(+) 플라스미드 및 PCR 생성물의 T4 리가제와의 결찰을 통해 재조합 발현 벡터를 구축하였다. 재조합 Bgl-16A는 C-말단에 His-태그를 함유하였다. 서열화된 bgl -16A를 갖는 재조합 벡터를 42℃에서 90초 동안 열 충격에 의해 대장균 BL21(DE3) 적격 세포 로 옮겼다 .
재조합 대장균은 37℃에서 회전 진탕기(220rpm)에서 100㎍/mL 카나마이신을 함유하는 LB 액체 배지에서 배양되었다. 재조합 Bgl-16A 단백질은 25℃에서 10시간 동안 0.6의 OD 600nm 에서 0.4 mM의 IPTG(isopropyl-β-thiogalactopyranoside)로 유도되었다. 유도 후, 4℃에서 10분 동안 10,000 rpm에서 원심분리하여 상청액을 수집하고 1X PBS 완충액(pH 7.2)으로 2회 세척하였다. 세포를 1X PBS 완충액에 재현탁한 후 SCIENTZ-IID 초음파 균질화기를 사용하여 20분 동안 초음파 처리했습니다. 12,000g 에서 원심분리하여 세포 파편을 제거했습니다.4°C에서 20분 동안. 상청액을 수집하고 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용했습니다. 결합되지 않은 단백질을 40mM 이미다졸로 세척하고 재조합 his-태그된 Bgl-16A 단백질을 1X PBS 완충액(pH 7.2)에서 200mM 이미다졸로 용출시켰다. 용출된 단백질과 정제된 단백질을 10% SDS-PAGE로 검출하였다. 단백질 함량은 BCA 방법으로 측정하였다.
Bgl-16A의 생화학적 특성
셀룰라아제 활성에 대한 pH의 영향은 인산염(pH 2.4-8.0) 및 Tris-HCl(pH 8.5-11.0) 완충액을 사용하여 50°C에서 10분 동안 pH 범위 2.4-11.0에 걸쳐 효소 활성을 분석하여 결정되었습니다. pH 안정성 분석을 위해 효소를 기질 없이 30분 동안 다른 완충액에서 50°C에서 인큐베이션한 다음 50°C에서 10분 동안 효소 활성을 측정했습니다.
반응 온도의 영향은 최대 pH에서 30분 동안 0 ~ 100°C(10°C 간격)에서 측정되었습니다. 효소의 열적 안정성은 위와 동일한 온도에서 30분 동안 평가한 후 통제된 조건에서 효소 활성을 측정하였다.
금속 이온(Na +, K + , Cu 2+ , Mg 2+ , Zn 2+ , Mn 2+ , Fe 2+ , Fe 3+ , Ca 2+ , [NH 4 ] + ) 및 화학 물질 나트륨 의 영향 10, 5 및 1mM 농도의 도데실 설페이트(SDS) 및 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)의 효소 활성은 실온에서 10분 동안 사전 배양한 후 표준 조건에서 측정되었습니다. 대조군에 대해 결정된 효소 활성을 100%로 설정하고 각 조건 하에서의 상대적 활성을 기록하였다.
우리는 Bgl-16A와 Cel-A 사이의 시너지 효과를 확인했으며 엔도 셀룰라아제가 균주 1AJ3에서 클로닝되었습니다. 1% CMC-Na, 1% Avicel 및 여과지를 기질로 사용하여 단일 효소 또는 결합 효소(V:V = 1:1)로 셀룰라아제 활성을 검출하였습니다. 효소 반응의 시너지 계수는 DS = U All / (U 1 + U 2 + …)로 정의하였으며, DS 값 > 1은 효소가 시너지 효과를 갖는다는 것을 의미합니다.
기판과의 분자 도킹
Bgl-16A의 아미노산 서열을 PDB 데이터베이스와 비교하였다.1 및 NCBI와 단백질 ID 3O5S와 99.08%의 동일성을 나타내어 서열의 86%를 커버하였다. 효소 활성 부위 선택은 단백질 3O5S에 따랐다. Bgl-16A 구조는 AlphaFold 2를 통해 얻었고 분자 도킹은 AutoDock 소프트웨어를 통해 수행되었습니다.
p-NPG 및 셀로비오스의 리간드 분자를 ChemDraw 소프트웨어에서 추출하고 초기에 RMS 0.001로 Chem3D(MM2 모듈)로 최적화했습니다. 단백질은 분자 도킹 수용체로 설정되었습니다. AutoGrid 4 모듈이 포함된 AutoDock 도구는 도킹을 수행하는 데 사용되었으며 이전 연구를 기반으로 E134 및 E138을 활성 아미노산 잔기로 정의했습니다 . AutoDock 소프트웨어는 100개의 도킹 결과를 완료하고 가장 적합한 것을 결정했습니다.
베타-글리코시드 가수분해효소에 의한 스위치그래스 및 커피 찌꺼기 당화
리그노셀룰로스 스위치그래스를 40메쉬 크기로 분쇄하고 커피 찌꺼기를 증류수로 세척하였다. 리그노셀룰로스 스위치그래스와 커피 찌꺼기를 60°C에서 밤새 건조했습니다. 완충액(pH 8.6)의 조 재조합 효소를 50°C에서 20시간 동안 5%(w/v) 스위치그래스로 당화했습니다. 조 효소 밀도의 세 가지 등급은 10, 20 및 40%(v/v)로 설정되었습니다. 이후 당화율은 다음과 같이 계산되었습니다.
데이터 및 통계 분석
각 실험은 3회 수행되었으며 결과는 Excel 2019를 통해 계산된 평균 ± SD로 표시됩니다.
결과
스위치그래스 분해 과정 중 문화의 변화
Bacillus subtilis 1AJ3를 스위치그래스와 함께 37℃, 150rpm에서 5일 동안 배양하였다. 스위치그래스 분해 동안 배양물의 pH는 3일째부터 7.5로 안정화되었습니다. 이 분석은 배양 배지가 초기에 산성이었기 때문에 균주가 산성 pH에서 성장할 수 있음을 보여주었습니다. 또한 균주는 배양 환경의 pH를 수정하여 성장에 도움이 됩니다.
분해 과정 동안 배양물에서 CMCase 활성은 처음에 증가했고 3일째에 최대 활성(7.49 U/100 mL)에 도달했습니다. 4일 후 감소하고 안정화되었습니다(3.94 U/100 mL). 공동 배양 동안 박테리아는 스위치그래스를 분해하여 환원당을 생성하고 환원당을 에너지로 소비했습니다. 따라서 환원당 함량은 두 사건의 순생산물입니다. 총 환원당 함량은 처음에 하향 추세를 보였고 3일째에 안정화되었습니다. 처음 3일 동안 박테리아는 자체 성장 요구를 충족시키기 위해 환원당을 소비했습니다. 그 후 스위치그래스 분해와 박테리아 대사의 안정화가 안정화되기 시작하여 당 수준을 약 1.13mg/mL로 낮추었습니다.
Bacillus subtilis 1AJ3 에 의한 Switchgrass lignocellulose 분해
스위치그래스는 B. subtilis 1AJ3 와 함께 5일 동안 배양하였고 , 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스(주로 자일란) 및 산불용성 리그닌 함량을 매일 모니터링하였습니다. 또한, 배양액 중의 글루칸 및 자일로스 함량을 HPLC로 측정하여 셀룰로오스 및 자일란 함량을 산출하였습니다.
박테리아를 사용한 배양 시간은 스위치그래스의 무게를 점진적으로 감소시켰고 스위치그래스 입자 크기는 감소시켰고 배양 유동성은 증가시켰습니다. 5일 동안 스위치그래스 셀룰로오스 및 자일란 헤미셀룰로오스 분해는 각각 16.13 및 14.24%였습니다. 산 불용성 리그닌 분해는 이 기간 동안 13.91%였습니다. 또한 산성 환경은 배양액에서 당을 가수분해시킬 수도 있습니다. 셀룰로오스 및 자일란 분해도 총 건조 중량에 비례하여 결정되었습니다. 마지막으로, B. subtilis 1AJ3에 의한 스위치그래스 가수분해와 그 에너지 소비는 상대적으로 유지되었습니다.
가스크로마토그래피-질량분석법에 의한 리그닌 분해 분석
스위치그래스 분해 중에 리그닌 함량이 감소하기 때문에 GC-MS를 사용하여 B. subtilis 1AJ3에 의한 리그닌 분해를 확인했습니다. 리그닌은 벤젠 고리를 가지고 있기 때문에 벤젠 고리를 가진 화합물의 분석은 일반적으로 리그닌 함량을 검출하는 데 사용됩니다. GC-MS는 스위치그래스 시료의 전처리 및 메틸실릴화 후 저분자량 벤젠 고리 함유 화합물을 정량화했습니다. 각 성분에 해당하는 방향족 화합물은 NIST 데이터베이스에서 확인되었습니다. 서로 다른 성분의 피크 면적을 통합하고 모든 방향족 화합물의 총 면적을 100%로 설정했습니다. 이어서, 상이한 벤젠 고리 함유 화합물의 비율(%)을 총 피크 면적에 대한 각각의 피크 면적으로 결정하였습니다.
방향족 화합물이 주요 리그닌 분해 관련 성분이므로, B. subtilis 1AJ3 대 블랭크 샘플 에서 벤젠 고리를 포함하는 방향족 화합물을 분석한 결과 큰 방향족 화합물이 더 작은 분자량 성분으로 분해되는 것으로 나타났습니다. 고분자량 방향족 화합물, 이소바닐산(CAS: 645-08-9), 1-hydroxy-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl) acetone(CAS: 4899-74-5) 및 트랜스페룰산( CAS: 537-98-4)은 B. subtilis 로 배양한 후 더 작은 성분으로 완전히 분해되었습니다.5일 동안 1AJ3. 성분 3-allyl-6-methoxyphenol(CAS: 501-19-9)은 부분적으로 분해되었으며, 그 함량은 균주와 함께 배양된 후 스위치그래스 시료에서 현저히 낮았다. 방향족 성분의 환원 외에도 2-메톡시페놀(CAS: 90-05-1), 쿠마린(CAS: 496-16-2), 페닐아세트산(103-82-2) 등 새로운 방향족 성분도 생성됩니다.
전계 방출 주사 전자 현미경에 의한 스위치그래스 열화 분석
FE-SEM은 B. subtilis 1AJ3 로 배양 전후 스위치그래스를 이미지화하는 데 사용되었습니다. 이 분석은 스위치그래스가 매끄럽고 콤팩트한 상태에서 완전히 조각난 상태로 진행됨을 발견했으며, 이는 박테리아가 스위치그래스를 상당히 분해했음을 나타냅니다.
산열 조건에서 Bacillus subtilis 1AJ3 의 내열성 과 바이오매스 분해
B. subtilis 1AJ3는 100°C 이하에서 자랄 수 없지만 80°C까지 견딜 수 있으며 일부 집락은 24시간 이내에 자랍니다. 더욱이 가장 놀라운 발견은 B. subtilis 1AJ3가 60°C에서 번성한다는 것입니다. 우리는 이전에 B. subtilis 1AJ3 에 대한 배지의 초기 pH의 영향을 평가했으며 박테리아가 높은 수준의 환원당 축적으로 낮은 pH(4.0)에서 성장할 수 있음을 발견했습니다. 낮은 pH 환경도 일부 셀룰로오스를 가수분해할 수 있기 때문에 균주가 바이오매스 셀룰로오스를 분해하기 위한 산 가열 성장 조건이 선호됩니다.
균주 1AJ3에 의한 두 가지 가수분해 조건을 바이오매스 원료에 적용하였습니다. 어떠한 원료도 전처리하지 않고 고온에서 처리하여 원료의 부착을 줄이고 다른 미생물을 억제하여 실험에 미치는 영향을 최소화하였습니다. 배양액의 환원당 함량은 3일 만에 동적 평형에 도달하므로 본 실험에서는 환원당 함량을 3일째에 결정하였습니다. 상이한 조건 하에서의 당 함량 감소를 비교하였습니다. 그런 다음 다양한 분해 조건에서 균주 1AJ3을 사용하여 산업용 에탄올 발효를 위한 다양한 바이오매스 리그노셀룰로오스의 실행 가능성을 평가했습니다.
테스트된 두 가지 조건에서 B. subtilis 1AJ3는 밀짚 및 왕겨에 거의 영향을 미치지 않았습니다. 그러나 스위치그래스, 옥수수 짚, 사탕수수 짚, 짚 속의 생강 및 땅콩 껍질에서 생성된 환원당 함량은 조건 2를 사용할 때 약간 더 높았다. 조건 1보다 조건 2는 옥수수 속대( 그림 4D ), 완두콩 짚( 그림 4G ) 및 커피 찌꺼기( 그림 4J) 에서 상당히 높은 수준의 환원당을 생성합니다.). 동일한 배양 회전 속도와 시간에서 박테리아가 환원당을 생산하기 위한 셀룰로오스 분해와 환원당 소비가 동적 평형 상태에 있을 때 조건 2(50°C, 초기 pH 4.0)는 조건에 비해 바이오매스 분해에 더 도움이 됩니다.
성장을 위한 박테리아의 환원당 함량 이용률은 셀룰로오스 분해로 생성된 환원당보다 더 커서 감소 추세를 보였습니다. 그러나 왕겨, 완두콩 짚 및 커피 찌꺼기는 상승 추세를 보였고, 커피 찌꺼기는 두 조건 모두에서 상승 추세를 보였습니다.
재조합 Bgl-16A의 발현 및 정제
bgl -16A 유전자 서열(732bp)은 244개의 아미노산을 암호화하는 것으로 나타났습니다 . 총 252개의 아미노산 서열을 갖는 C-말단에 His-태그를 포함하는 재조합 효소 Bgl-16A가 GenBank 액세스 번호 QIP68091.1로 NCBI 데이터베이스에 제출되었습니다. 아미노산 서열 폭발은 효소가 글리코실 가수분해효소(GH) 계열에 속하는 베타-1,3-1,4-글루카나제(PBD id: 3O5S)의 서열과 99.08% 동일성 및 86% 커버리지를 가짐을 보여주었습니다.
재조합 베타-글리코시다아제 가수분해효소는 대장균 에서 발현되었고 Ni-NTA 컬럼을 사용하여 정제되었습니다. 40mM 이미다졸을 사용하여 불순한 단백질을 제거한 후 정제된 단백질은 200mM 이미다졸을 사용하였다. 정제된 재조합 Bgl-16A 및 정제 과정을 나타내었다 . 정제된 Bgl-16A의 분자량( Mw )은 약 26kDa로 예상 분자량과 일치하였다. 정제된 재조합 Bgl-16A는 365.29 ± 10.43 U/mg의 높은 효소 활성을 보였습니다.
재조합 Bgl-16A의 특성
상이한 pH 및 온도에서 재조합 Bgl-16A의 효소적 및 생리학적 특성화는 최적 pH가 8.6이고 온도가 50℃임을 보여주었습니다. 최대 효소 활성의 80% 이상이 pH 7.0과 9.0 사이에 도달하여 Bgl-16A가 중성 및 약알칼리성 반응 조건에 적합함을 나타냅니다. 4.5 미만의 pH 수준에서 재조합 단백질 침전물 및 활성 손실이 관찰되었습니다. Bgl-16A에 대한 최적의 안정성 pH는 6.4와 9.0 사이에 있습니다, 상대 효소 활성이 93% 이상입니다. Bgl-16A의 최적 온도는 50°C였습니다. 따라서 엄격하게 온도가 필요한 효소입니다. 50°C 이상 또는 이하의 온도에서는 효소 활성이 50% 미만으로 감소했습니다. 60°C에서 30분 동안 효소 활성이 검출되지 않았습니다. Bgl-16A는 고온에서 어떠한 내열성 특성도 나타내지 않았지만 저온에서는 안정적인 활성을 보였습니다.
재조합 Bgl-16A 베타-글리코시드 가수분해효소 활성에 대한 금속 이온의 효과는 거의 금속 이온이 효소 활성을 증가시키지 않았습니다. 이에 비해 Ca 2+는 다른 농도에서 효소 활성을 감소시킬 수 있습니다. SDS는 또한 효소 활동에 영향을 미치지 않았습니다. EDTA는 고밀도(5mM 이상)에서 효소 활성을 억제할 수 있는 반면 저밀도(1mM)에서는 그렇지 않았습니다. 또한 시너지 효과는 Bgl-16A와 endo-cellulase Cel-5A가 CMCase, Avicelase 및 FPase에서 각각 DS 값이 1.195, 1.303 및 1.247로 상승 작용을 함을 시사하였다 .
서열 분석, 상동성 모델 및 분자 도킹
재조합 효소는 His-tag를 포함하여 252개의 아미노산으로 구성됩니다. 이론적인 pI와 분자량은 각각 6.79와 28.55 kDa로 측정되었습니다. Bgl-16A는 베타 샌드위치 구조를 나타내는 아미노산 35-242에 걸쳐 있는 GH16 도메인을 가지고 있습니다. 상동성 모델은 AlphaFold 2를 기반으로 합니다. 촉매 잔기의 활성 부위는 PBD 데이터베이스의 3O5S 구조에 따라 134E와 138E였습니다. 단백질은 이전 연구에서와 같이 두 개의 병치된 구부러진 역평행 베타 시트의 전형적인 구조를 보여주었습니다 . 그러나 이전 연구에서는 베타-1,3-1,4-글루카나아제를 조사하기 위한 효소 가수분해 기질로 이끼만을 고려했으며 분자 도킹을 위해 비스-트리스-프로판 분자를 사용했습니다.
분자를 100번 도킹하고 도킹이 끝날 때까지 RMSD 값을 사용하여 다른 그룹으로 나누었습니다. 보충 파일 2 에 표시된 분자 도킹 결과의 클러스터 분석p-NPG가 cellobiose와 비교할 때 도킹 및 클러스터링이 더 우수함을 나타냅니다. p-NPG는 Bgl-16A 공동에 안정적으로 결합할 수 있으며 결합 에너지는 –5.72 kcal/mol입니다. -7.0보다 낮은 AutoDock 점수 값은 대상이 화합물과 강한 결합 능력을 가지고 있음을 나타냅니다. 반대로 -5.0에서 -7.0 사이의 점수 값은 화합물의 작은 분자가 표적과 좋은 결합 능력을 가지고 있음을 나타내고, -5.0에서 -4.25 사이의 점수 값은 화합물이 표적과 어느 정도 결합 능력을 가지고 있음을 나타냅니다. 거대 분자 표적. p-NPG는 주로 소수성 상호작용, 수소결합, π-스태킹(침전) 상호작용을 통해 작용했습니다. p-NPG는 단백질의 TRP221 및 TRP213과 소수성 상호작용을 형성할 수 있습니다. 수산기는 ASP136, GLU138, GLN148, ASN150, TYR152 및 GLU160과 수소결합 공여체로 안정적인 수소결합을 형성할 수 있다. 벤젠 고리는 또한 PHE59와 π-스태킹(stacking) 공액 상호작용을 형성할 수 있습니다.
Cellobiose는 -4.78kcal/mol의 결합 에너지로 단백질 공동에 안정적으로 결합할 수 있습니다. 셀로비오스 분자는 주로 소수성 상호작용과 수소결합 상호작용을 통해 상호작용한다. 화합물은 MET58, TRP132, TYR123 및 PHE121과 소수성 상호작용을 형성할 수 있습니다. 화합물의 수산기는 수소결합 공여체로 작용하여 단백질의 GLN134, ASP136, GLU138, GLN148, ASN150, TYR152, GLU160과 안정한 수소결합을 형성할 수 있으며, 이것이 활성 부위와의 결합을 촉진하는 주된 힘입니다.
리그노셀룰로오스 전처리에서 Bgl -16A 의 잠재적 응용
리그노셀룰로스 또는 바이오매스 폐기물에서 Bgl-16A의 적용을 추가로 탐색하기 위해 리그노셀룰로스 스위치그래스를 기질로 사용하여 가수분해 및 당화 능력을 감지했습니다. 또한 커피 찌꺼기를 기질로 적용하여 적용 범위를 넓혔습니다. 조 효소는 실험의 이 부분에 사용되었습니다.
20시간 동안 효소 배양 후, 가수분해 현상이 명백하였습니다. 걸쭉한 셀룰로오스 입자는 가늘고 느슨해졌으며, 리그노셀룰로오스는 효소량이 증가함에 따라 얇아졌다. 이것은 특히 커피 찌꺼기의 경우에 해당되며, 암갈색 분쇄 알갱이가 밝은 색의 느슨한 작은 입자로 변했습니다.